基于網絡藥理學闡述青風藤對類風濕性關節炎的作用機制

丁文聰 韓隆胤 錢凱 林昌松

[摘要] 目的 通過網絡藥理學探究青風藤治療類風濕性關節炎（RA）的藥理機制，為RA的臨床治療提供理論依據。 方法 檢索時間為建庫至2018年12月，基于TCMSP、TCMID數據庫搜集青風藤成分及靶點，通過Cytoscape軟件構建成分-靶點網絡;通過TTD、Drug Bank數據收集RA相關靶點，在STRING數據庫構建靶點互作（PPI）網絡。在Genomics數據庫分析藥物和疾病共有靶點，并利用Cytoscape軟件中Cluego插件分析共同靶點的信號通路，最后構建成分-靶點-通路網絡圖并分析。 結果 青風藤發揮治療RA的成分可能是拉茲馬寧堿、千金藤啶堿、青藤堿等;發揮治療作用的靶點可能包括Jun激酶（JUN）、維甲酸X受體（RXRA）、過氧化物酶體增殖活化受體γ（PPARG）等;關鍵作用通路包括PPAR通路、脂代謝調控、PTEN基因轉錄、核細胞受體及轉錄等13條。 結論 青風藤通過多組分、多靶點、多通路發揮鎮痛消炎、減輕骨破壞等作用，對RA的治療具有一定的價值。

[關鍵詞] 網絡藥理學;青風藤;類風濕性關節炎;成分-靶點-通路網絡圖

[中圖分類號] R593.22? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）06（b）-0015-06

Mechanism of Caulis Sinomenii on rheumatoid arthritis based on network pharmacology

DING Wencong1，2? ?HAN Longyin2? ?QIAN Kai2? ?LIN Changsong1

1.Department of Rheumatology and Immunology， the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou? ?510000， China; 2.the First Clinical School， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangdong Province， Guangzhou? ?510000， China

[Abstract] Objective To explore the pharmacological mechanism of Caulis Sinomenii in the treatment of rheumatoid arthritis （RA） through network pharmacology， and to provide theoretical basis for the clinical treatment of RA. Methods The retrieval time was from the establishment of the database to December 2018. Based on the TCMSP and TCMID database， the components and targets of Caulis Sinomenii were collected， and the component-target network was constructed through the software of Cytoscape. RA related targets were collected through TTD and Drug Bank data， and the target interaction （PPI） network was constructed in the STRING database. The common target of drugs and diseases was analyzed in Genomics database， and the signal pathway of common target was analyzed by using Cluego plugin in the software of Cytoscape. Finally， the component-target-pathway network diagram was constructed and analyzed. Results The therapeutic components of Caulis Sinomenii in the treatment of RA might be 16-epi-Isositsirikine， Stepholidine， Sinomenine， etc.; the therapeutic targets might include Jun proto-oncogene （Jun）， Retinoid X receptor alpha （RXRA）， peroxisome proliferative activated receptor gamma （PPARG）， etc.; the key pathways included PPAR pathway， lipid metabolism regulation， PTEN gene transcription， nuclear cell receptor and transcription， etc.. Conclusion Caulis Sinomenii can relieve pain and inflammation and reduce bone destruction through multi components， multi targets and multiple pathways， which has a certain value for the treatment of RA.

[Key words] Network pharmacology; Caulis Sinomenii; Rheumatoid arthritis; Component-target-pathway network diagram

類風濕性關節炎（RA）是一種常見的能引起嚴重畸形的慢性全身性結締疾病，它除累及多個關節外，還可侵犯全身各處的結締組織[1]。西醫治療對病情的緩解和改善有一定作用，但遠期療效和副作用有待觀察。較多文獻及古籍對中草藥治療RA都有記載，效果較好且副作用小。青風藤化學成分包含青藤堿、千金藤啶堿、木蘭堿、尖防己堿等，具有抗炎、鎮痛作用[2]。但其具體的活性物質基礎及藥理作用分子機制仍不明確。網絡藥理學在中藥活性成分群及作用靶點、作用機制、組方規律、新適應證及新活性化合物等方面具有獨特優勢。本文基于網絡藥理學闡述青風藤對RA的作用機制，為臨床治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 青風藤活性成分及靶點篩選

檢索時間為建庫至2018年12月，以“青風藤”為關鍵詞，通過檢索中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）搜集青風藤所有化學成分。根據藥物的吸收、分布、生物轉化和外排（ADME），以口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18為條件，篩選出青風藤活性成分;將選取的活性成分通過Drug Bank、TCMSP數據庫（https：//www.drugbank.ca/）進行靶點基因篩選，并通過Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org/）校正基因信息。

1.2 RA靶點搜集

使用Drug Bank數據庫及TTD數據庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）檢索RA有關靶點。使用Uniprot數據庫規范基因信息，研究物種為“Human”，在檢索結果中刪除重復的靶點，即得到RA發病機制中有關的靶點。

1.3 靶點蛋白質相互作用網絡（PPI）構建

將青風藤治療RA的預測靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org/），設置研究物種為“Homo sapiens”（人類），最低相互作用評分為中等可信度（0.4～0.7），隱藏離散靶點，其他參數保留默認值，得到PPI網絡。最后，利用R腳本對STRING數據庫中獲取的靶點之間的相互作用進行計數排序，從而得出疾病的核心靶點。

1.4 青風藤“成分-靶點網絡”

將青風藤成分和靶點導入可視化軟件Cytoscape（http：//cytoscapeweb.cytoscape.org/）中，構建青風藤成分-靶點網絡，并進行網絡拓撲分析。靶點度值是拓撲結構中的重要參數之一，表示網絡與節點連接的路徑數，可用于評估青風藤成分和靶點的重要性。

1.5 共同靶點篩選

通過Genomic（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）數據庫，取成分靶點與RA靶點交集，得到青風藤和RA的共有靶點。

1.6 “成分-靶點-通路網絡”建設與分析

采用Cytoscape軟件中ClueGO插件進行KEGG信號通路富集分析，構建成分-靶點-通路網絡圖，并使用網絡分析工具明確重要成分、靶點和路徑。

2 結果

2.1 RA靶點排列

通過對Drug Bank和TTD數據庫檢索，分別收集到161個和100個靶點，合并后共獲得241個靶點。根據節點的Degree得到度值相關靶點排列。見表1。

2.2 青風藤成分及靶點

通過TCMSP數據庫，根據設置的ADME條件，青風藤中包含7個成分和118個靶點，主要活性成分見表2。

2.3 中藥“成分-靶點網絡”

2.3.1 PPI網絡構建? 為明確青風藤中靶蛋白的相互作用，將上述通過篩選得到的靶蛋白在STRING平臺構建PPI網絡模型，見圖1。

2.3.2 成分-靶點網絡的構建? 成分-靶點網絡見圖2，總共有67個節點和118條邊，平均Degree為1.76。排名前4的4種成分是拉茲馬寧堿、千金藤堿、β-谷甾醇和青藤堿。Degree排名前5的靶點為核受體輔激活因子2（NCOA2）、PPARG、前列腺素G/H合成酶1（PTGS1）、PTGS2、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基，γ同種型（PIK3CG）。

2.4 疾病和成分共同靶點的篩選

通過Genomics數據庫收集中藥和疾病的共同靶點，共3個（JUN、RXRA、PPARG），見圖3。

2.5 Cluego通路分析

通過“Cluego插件”中的KEGG、REACTOM、Wiki-Pathways數據庫，篩選出5個類別和16條信號路徑，見圖4。其中，大多數富集于PPAR通路、脂代謝調控的通路上，而與RA存在較大關系的信號通路可能有PPAR通路、脂代謝調控、PTEN基因轉錄、核細胞受體與轉錄等13條，見表3。

2.6 成分-靶點-通路網絡構建與分析

將“2.1”～“2.5”結果導入Cytoscape軟件構建網絡，見圖5。利用網絡分析工具篩選出可能發揮治療作用的重要成分、靶點和通路。從圖中可知，青風藤重要的成分很可能是拉茲馬寧堿、千金藤啶堿、β-谷甾醇;重要的靶點很可能有JUN、RXRA、PPARG;重要的通路很可能是PPAR通路、脂代謝調控、PTEN基因轉錄、核細胞受體及轉錄等多條通路。

3 討論

根據PPI網絡分析，JUN、RXRA、IL-6、PPARG等可能為RA關鍵靶點。研究表明，細胞因子網絡失調與RA發病密切相關。PPARG與RA炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）表達相關，可能與RANK/OPG系統介導的破骨細胞形成及活化來抑制RA骨破壞相關[3]。IL-6在活動期RA患者血清和受累關節的滑液中濃度升高，高濃度的IL-6可誘導血管翳的形成，激活破骨細胞，使破骨細胞與成骨細胞關系失調，導致關節骨破壞[4]。另外，有研究發現，RA患者的炎癥活性、貧血和生理功能可能與脂蛋白的代謝有關[5]。已證實JUN參與細胞凋亡、增殖、代謝、運動和其他細胞生命過程，其功能障礙被認為與多種疾病和病理損害密切相關[6]。

根據中藥“成分-靶點網絡”分析，關鍵成分可能為拉茲馬寧堿、千金藤啶堿、β-谷甾醇和青藤堿。青藤堿具有顯著的鎮痛、鎮靜、抗炎、抗癌、促組胺釋放、降血壓、降糖及抗心律失常等藥理作用[7]，其通過抑制核轉錄因子的活性抑制樹突狀細胞的成熟和協同刺激分子的表達，影響其激活T細胞的功能而達到治療RA的作用[8]。林明珠等[9]研究表明，β-谷甾醇與體內的IL-6水平相關，促進細胞凋亡，對于RA的疾病活動有直接的聯系。金國章[10]研究表明，千金藤啶堿可以激活大腦中的抗痛覺調制系統，抑制脊髓背角通過下行通路傳遞疼痛信息，發揮中樞鎮痛的生理活性。此外，核心靶點可能是NCOA2、PPARG、PIK3CG、PTGS1、PTGS2。有研究表明，PIK3CG通路可以抑制家族性地中海熱患者炎性反應[11]。PTGS1、PTGS2在體內炎性反應中起重要作用，臨床使用非甾體抗炎藥物通過抑制前列腺素環氧合酶和防止花生四烯酸轉化來發揮抗炎鎮痛作用[12]。

結果表明，PPAR通路和脂質代謝調控通路中的大多數基因均顯著富集。目前的研究表明，與RA相關的信號通路很可能有PPAR通路、脂代謝調控、PTEN基因轉錄、核細胞受體等13條。脂代謝調控的通路在RA的炎癥進程中有重要地位，其中白色脂肪組織（WAT）不僅是人體脂肪的儲備，在維持人體內環境平衡方面起著重要作用，人體的WAT還產生50多種脂肪因子，通過內分泌和旁分泌的方式參與人體的各種病理生理過程[13]。脂代謝過程亦調控著瘦素的分泌，瘦素可促進Th1細胞的活性而抑制調節性T細胞（Treg）的增殖[14]。實驗證明，脂聯素能促進RA患者成骨細胞分泌更多的促炎因子，從而刺激破骨細胞分泌白介素-8（IL-8）以增加骨質破壞。脂聯素促進破骨細胞中基質金屬蛋白酶（MMP）的表達，這有助于基質降解[15]。內臟脂肪素可以刺激CD14+單核細胞，通過MEK1和p38信號通路分泌IL-6、IL-1β、TNF-α，并刺激淋巴細胞增殖，促進炎癥指標的升高[16]。不同于基因富集的通路，PTEN亦在抑制細胞生長、促進細胞凋亡中起著關鍵作用。研究表明，RA患者中成纖維細胞樣滑膜細胞（RA-FLS）中的PTEN呈低表達，可能造成下游Akt（Thr308）磷酸化水平上升，并引起大鼠RA FLS中的Akt磷酸化水平下降，血管內皮生長因子產生減少，FLS凋亡增加，減輕炎癥環境[17]。另有研究表明，孤兒核受體γt（RORyt）是Th17細胞特異性的一種轉錄因子，可有效調控白介素-17（IL-17）的分泌[18]。在RA進展中，Th17細胞是CD4+輔助T細胞亞型，不同于Th1和Th2細胞亞型，可產生促炎性細胞因子IL-17[19]。此外，RA的發病與破骨細胞、成纖維細胞、軟骨細胞等凋亡過程密切相關[20]。其中破骨細胞在RA骨破壞的病理過程中起關鍵作用，多種細胞因子參與破骨細胞的形成和活化[21]。

綜上所述，青風藤治療RA的藥理學機制是通過多組分、多靶點、多通路實現其鎮痛消炎、減輕骨破壞的目標，從網絡藥理學上更加證實青風藤治療RA具有一定的價值。

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（收稿日期：2020-01-06? 本文編輯：李亞聰）