HBO聯合GSH對大鼠下肢缺血再灌注損傷的影響

倪建琦 許瀏 沈蘭 金琴

血流再灌注是機體缺血后恢復正常功能的必要步驟，再灌注后引發的機體損害不僅會導致局部組織受損，還可引發遠位器官的損傷，嚴重者甚至出現多器官的功能衰竭。因此，如何減輕缺血再灌注損傷（IRI）成為當前臨床研究的熱點。研究表明，高壓氧（HBO）具有促進內皮細胞分化、改善組織缺血缺氧微環境等作用，可能對減輕IRI有益［1］。還原型谷胱甘肽（GSH）是一種具有抗氧化作用的肽類物質。GSH通過與缺血再灌注引發的氧化劑和自由基結合，起到抑制氧化劑和自由基損傷相關蛋白和重要臟器的作用［2］。作者采用大鼠下肢IRI模型，通過研究不同組間大鼠血清的炎癥因子和氧化應激指標水平的差異，探討HBO和GSH以及其聯合應用對下肢IRI的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）動物：40只8周齡成年雄性健康SD大鼠由溫州醫科大學實驗動物中心提供，體重220～250g，分籠飼養。（2）主要試劑與設備：藥物：GSH由山東綠葉制藥有限公司生產，批號：H20030001。臨時用0.9%氯化鈉配制。試劑：IL-8、TNF-α、SOD和MDA的大鼠elisa試劑盒均購置于上海泛柯生物科技有限公司。設備：高壓氧艙（山東濰坊華信高壓氧艙有限公司）。

1.2 方法 （1）試驗動物分組：將40只大鼠按照隨機數字表法隨機分為5組：假手術組（S組）、缺血再灌注組（IR組）、高壓氧組（HBO組）、還原型谷胱甘肽組（GSH組）、高壓氧+還原型谷胱甘肽組（HBO+GSH組），每組各8只。（2）動物模型制備：適應性喂養1周后，參照文獻［3］報道制備缺血再灌注（IR）模型：大鼠術前常規禁食12h，不禁水，將麻醉（腹腔注射劑量3%戊巴比妥鈉）后的大鼠仰臥位固定，備皮消毒后，取下腹部正中切口，依次切開皮膚、肌肉、前腹膜及后腹膜，暴露腹主動脈和下腔靜脈。用無創血管夾夾閉腹主動脈，按照20ml/kg在腹腔內保留生理鹽水，關閉切口，用鹽水紗布覆蓋。2h后再次打開腹腔取出血管夾。再次按照20ml/kg在腹腔內保留生理鹽水后，縫合切口，恢復血流2h，獲得IR模型。（3）試驗動物處理：①S組：只開腹后游離腹主動脈，不夾閉腹主動脈。②IR組：開腹后游離腹主動脈，無創動脈夾夾閉腹主動脈2h后恢復血流2h。③HBO組［4］：先用純氧洗艙5min，待艙內氧的體積分數>90%，放入已經夾閉腹主動脈1h的大鼠，在5min內將艙內壓力升至2.4ATA（1ATA=101.3kPa），穩壓45min，減壓15min。氧流量約為2L/min。余同IR組。④GSH組：夾閉腹主動脈2h，再灌注時將GSH（120mg/kg）自下腔靜脈注入大鼠體內，余同IR組。⑤HBO+GSH組：再灌注時將GSH自下腔靜脈注入，余同HBO組。（4）血清指標檢測：再灌注2h后，從大鼠心尖處取血5ml于EP管中，靜置30min后，離心（3000r/min，10min）取上清液，-20℃保存待檢。使用ELISA法檢測IL-8、TNF-α、SOD和MDA含量。具體操作按照各試劑盒說明書嚴格執行。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件統計。計量資料用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 5組大鼠血清炎癥因子水平的比較 與S組比較，再灌注2h后，IR組、HBO組和GSH組大鼠血清IL-6和TNF-α水平均發生升高（P<0.05）。與IR組相比，HBO組、GSH組、HBO+GSH組血清IL-6和TNF-α水平均發生下降，其中HBO+GSH組下降最為明顯（P<0.05）。見表1。

表1 5組大鼠血清炎癥因子水平的比較（）

表1 5組大鼠血清炎癥因子水平的比較（）

注：與S組比較，*P<0.05；與lR組比較，#P<0.05；與HBO組比較，△P<0.05；與GSH組比較，▲P<0.05

組別 IL-6（pg/ml） TNF-α（pg/ml）IR 組 92.32±6.46* 39.16±3.62*#HBO 組 83.57±5.92*# 35.72±3.37*#GSH 組 80.85±5.81*# 34.18±3.25*#HBO+GSH組 74.34±5.42#△▲ 30.24±3.18#△▲S組 71.69±5.78 27.51±3.13

2.2 5組大鼠血清氧化應激指標水平比較 與S組比較，再灌注2h后，IR組、HBO組、GSH組和HBO+GSH組大鼠血清MDA水平均發生升高（P<0.05），SOD水平均發生下降（P<0.05）。與IR組相比，HBO組、GSH組、HBO+GSH組血清MDA水平均發生下降，其中HBO+GSH組下降最為明顯（P<0.05）。與IR組相比，HBO組、GSH組、HBO+GSH組血清SOD水平均發生升高，其中HBO+GSH組升高最為明顯（P<0.05）。見表2。

表2 5組大鼠血清氧化應激指標水平的比較（）

表2 5組大鼠血清氧化應激指標水平的比較（）

注：與S組比較，*P<0.05；與lR組比較，#P<0.05；與HBO組比較，△P<0.05；與GSH組比較，▲P<0.05

組別 MDA（nmol/ml） SOD（U/ml）IR 組 5.57±0.45* 66.32±15.19*HBO 組 5.01±0.36*# 86.68±15.78*#GSH 組 4.83±0.39*# 97.49±17.81*#HBO+GSH組 4.48±0.42*#△▲ 118.46±19.93*#△▲S組 4.05±0.32 138.55±17.15

3 討論

IRI多見于休克時微循環疏通、冠狀動脈痙攣緩解、斷肢再植以及動脈搭橋和溶栓治療等手術，其病理生理過程復雜，發生機制尚未完全闡明。通常認為與氧自由基增多、白細胞激活、細胞內鈣超載、電解質失衡以及代謝紊亂等有關［5］。炎癥反應是IRI發生過程中主要的病理過程之一。一方面由于處于缺血狀態的組織激活中性粒細胞，促使大量炎性因子產生和釋放；另一方面再灌注時會產生大量的氧自由基，導致DNA和蛋白質的斷裂、變性，進而刺激炎性細胞浸潤，并分泌大量炎性因子。此外，IRI還可以激活NF-κB通路，進一步加劇炎癥反應［6］。TNF-α和IL-6是IRI期間重要的炎癥細胞因子。其中TNF-α是IRI最為敏感、也是最先出現升高的因子，其由單核－巨噬細胞分泌后，一方面會誘導IL-6、IL-8等炎癥因子分泌，另一方面其還會損傷血管內皮，加劇IRI損傷。IL-6是重要的急性炎癥反應介質，其可誘導多種炎癥細胞功能上調，造成組織的損傷［7］。

氧自由基增多是機體IRI后常見的病理特征。機體缺血導致靜脈回流受阻，體內產生的氧自由基和脂質過氧化物不能被及時清除，導致機體的損傷。此外，細胞缺氧會促使高能磷酸化合物大量分解，引起代謝產物蓄積，進而損傷機體［8］。過量的氧自由基與細胞膜內不飽和脂肪酸反應可生成MDA。SOD是體內存在的一種抗氧化酶，具有清除體內氧自由基，平衡機體氧化水平，保護細胞免受氧化損傷的作用［9］。

本研究結果顯示，與IR組比較，HBO 組大鼠血清IL-6、TNF-α和SOD水平均發生下降，MDA水平發生升高。表明HBO有助于減輕下肢IRI。這可能與HBO可提高血液內的氧含量和氧張力、有效降低組織無氧酵解水平，進而改善機體缺氧狀態有關。此外，HBO還可以擴張血管、加快血流速度、改善微循環，從而減輕組織缺氧損害［10］。與IR組比較，GSH組大鼠的血清IL-6、TNF-α和SOD水平均發生下降，MDA水平發生升高。表明GSH有助于緩解下肢IRI。研究表明，GSH通過清除氧自由基，可以提高組織氧化酶活力，減輕脂質過氧化程度，保護細胞結構［11-12］。GSH還可以抑制細胞內鈣超載，抑制TNF-α、IL-6、IL-8等細胞因子的合成，從而減輕IRI。與HBO和GSH比較，HBO+GSH組大鼠的血清IL-6、TNF-α和SOD下降更為明顯，MDA水平升高更加顯著。表明在緩解下肢IRI方面，HBO和GSH具有協同保護作用。可能機制為：HBO治療發生于大鼠的缺血期，有助于減少該時期組織的氧自由基生成和組織缺氧損傷。GSH治療著重針對大鼠的再灌注期，通過清除體內的氧自由基，調節鈣平衡，改善大鼠下肢IRI。

綜上所述，在缺血期給予HBO干預，再灌注期給予GSH治療，可能有助于減輕和預防臨床患者下肢IRI的發生。本研究仍有諸多不足，如HBO和GSH干預時機的選擇以及不同HBO和GSH治療次數對機體保護作用的差異等要點在本研究中均未深入涉及。因此，關于HBO和GSH在下肢IRI中的作用，尚需要大量相關研究予以深入探討。