瘢痕疙瘩中微小RNA-34b的表達及與轉化生長因子-β₁的相關性

林簡 劉曉紅 王榮坤 李濤 李娜 陳惠娟

[摘要]目的：檢測瘢痕疙瘩中微小RNA-34b（miR-34b）的表達，分析其與轉化生長因子-β1（TGF-β1）的相關性。方法：收集42例瘢痕疙瘩術后組織作為觀察組，收集42例增生性瘢痕術后組織作為對照組，收集正常皮膚組織42例作為正常對照組。應用實時熒光定量PCR法檢測三組中miR-34b的表達，應用免疫組化和Western Blot法檢測觀察組中TGF-β1的表達。結果：觀察組中miR-34b的表達明顯低于對照組和正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。觀察組中miR-34b的表達在有無家族史及不同病變高度的分組中差異有統計學意義（P<0.05）;而在不同性別、年齡、病程的分組中差異無統計學意義（P>0.05）。相關分析顯示miR-34b與TGF-β1呈負相關性。結論：瘢痕疙瘩中miR-34b低表達，與家族史及病變增生的高度相關。miR-34b與TGF-β1具有協同負向作用。

[關鍵詞]瘢痕疙瘩;miR-34b;轉化生長因子-β1;相關性;增生性瘢痕

[中圖分類號]R619+.6? ? [文獻標志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2020）07-0093-03

Abstract： Objective? To detect the expression of microRNA-34b （miR-34b） in keloid， analyze its correlation with transforming growth factor-β1（TGF-β1）. Methods? 42 cases of keloid were collected as the observation group. 42 cases of hypertrophic scar were collected as the control group. 42 cases of normal skin were collected as the normal control group. The expression of miR-34b was detected by real-time fluorescent quantitative PCR， and TGF-β1 was detected by immunohistochemistry and Western Blot method. Results? Expression of miR-34b was significantly lower in the observation group than that in the control group and the normal control group， the difference is statistically significant（P<0.05）. The expression of miR-34b was statistically significant in family history and different lesion hight（P<0.05）， but there was no significant difference in gender， age and course of disease（P>0.05）. Correlation analysis showed that miR-34b was negatively correlated with TGF-β1. Conclusion? Lower expression of miR-34b is related to family history and lesion height. MiR-34b and TGF-β1 have synergistic negative effects.

Key words： keloid; miR-34b; TGF-β1; correlation; hypertrophic scar

瘢痕疙瘩是皮膚創傷愈合過程中形成的病變，主要為成纖維細胞異常增殖、膠原過量沉積引起的纖維組織過度增生[1]。臨床上因瘢痕攣縮引起的功能異常也較為常見。目前瘢痕疙瘩發生的分子生物學機制不明確。有研究顯示高表達的轉化生長因子-β1（TGF-β1）具有促進成纖維細胞增殖及細胞外基質合成的作用，其常通過SMAD、MAPK和PI3K等通路發揮作用[2]。近年來有學者關注到微小RNA（miRNA）可能與病理性瘢痕的形成有關。miRNA是一種非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核動物體內，與其他基因的非編碼區域互補，在轉錄和翻譯水平上調控基因的表達[3]。借鑒腫瘤學中的篩選方法，選擇與侵襲相關的miR-34b進行研究，并應用TargetScan和RNA22數據庫預測到TGF-β1可能是miR-34b的靶因子?；诖?，本實驗進行前瞻性研究，觀察miR-34b在瘢痕疙瘩中的表達意義，分析其與TGF-β1的相關性，以期為研究病理性瘢痕的發生發展提供幫助。

1? 資料和方法

1.1 臨床資料：選擇筆者醫院2018年1月-2019年6月確診為瘢痕疙瘩并行手術治療的患者42例作為觀察組。納入標準：①腫塊隆起于皮膚表面，質硬，表面光滑發亮，界限欠規則，1年內無自然消退跡象;②病變超出原始損傷邊緣，向周圍正常組織發生浸潤，蟹足狀生長;③具有持續性生長、發紅、痛癢等癥狀，無自愈傾向，不能自行消退;④病理學證實瘢痕組織內有膠原及基質成分的大量沉積，成纖維細胞很多，并有分裂像。其中男22例，女20例，年齡18～36歲，平均為（24.0±4.9）歲。選擇同期在筆者醫院確診為增生性瘢痕并行手術治療的患者42例作為對照組。納入標準：損傷因素明確、瘢痕色澤紅、質硬，高出皮膚，瘢痕的增殖不超過損傷范圍。其中男20例，女22例，年齡19～42歲，平均為（26.7±4.2）歲。選擇同期因體表皮下良性腫物切除術時切取的正常皮膚組織42例作為正常對照組，其中男21例，女21例，年齡18～36歲，平均為（23.9±4.0）歲。均留取術后的新鮮組織（-80℃凍存）及石蠟包埋組織。三組性別、年齡比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準，患者或家屬簽定知情同意書。

1.2 樣本量評估：應用兩樣本均數比較的評估方法：即n1=n2=2[（uα+uβ）/δ/σ]2+1/4uα2，按預實驗中miR-34b的表達并查閱文獻，擬正常皮膚組織中的表達量為2.2，瘢痕疙瘩中的表達量為1.1，二者的差值是1.1，如果σ=1.1，δ/σ=0.9，α=0.05，計算n1=n2≈42例。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR實驗：應用實時熒光定量PCR（qPCR）法檢測miR-34b的表達，檢測基于新鮮標本。miR-34b引物上游：5'-ATCGGCCCAAAGTGGTG-3'，下游：5'-ACAAACTGGACTCAGCTT-3'。以U6為內參，上游：5'-GGAACGAGAAAGATTAGC-3'下游：5'-TTGGAATTCACGAAATTCCG-3'。引物由蘇州睿贏生物技術公司合成。嚴格按說明書進行操作。反應程序：95℃ 5min，1個循環;95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，15個循環;93℃ 25s，60℃ 35s，72℃ 20s。共40個循環。60℃時采集信號，記錄Ct值，通過2-ΔΔCt法計算目的基因。ΔΔCt=[Ct目的基因（未知樣品）-CtGAPDH（未知樣品）]-[Ct目的基因（校正樣品）-CtGAPDH（校正樣品）]。

1.3.2 免疫組化實驗：瘢痕疙瘩中TGF-β1的表達應用免疫組化SP法。試劑購自武漢博士德生物技術公司。常規取材、脫水、石蠟包埋后，切取4μm切片。先進行預實驗，選擇TGF-β1為1：150的濃度用于正式實驗，行DAB顯色。嚴格按實驗步驟操作，做好質控工作。結果由病理醫師應用盲法評定。TGF-β1的陽性部位是細胞質，以淺黃到棕褐色定為陽性。著色強度：以無、淺黃、黃、棕褐色分別計為0分、1分、2分、3分、4分。隨機選擇3個400倍視野進行計數，取陽性率的平均值，以陽性率<5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、>75%分別計為0分、1分、2分、3分、4分，兩者相加為最終評分，總分0～7分。以≥3分為陽性，以<3分為陰性，計算陽性率。

1.3.3 Western Blot實驗：瘢痕疙瘩中TGF-β1的半定量表達應用Western Blot檢測。嚴格按實驗步驟進行蛋白提取、蛋白濃度測定、蛋白變性、加樣、電泳、電轉膜、免疫雜交后，取出膜后加入超敏發光液，發光時間3min。X膠片盒曝光2min，顯影25s。應用Image J分析，以TGF-β1與GAPDH的比值作為相對表達量。

1.4 統計學分析：應用SAS 6.12軟件進行分析，率的比較應用卡方檢驗，定量資料應用均數±標準差表示，兩組間比較應用t檢驗，多組間比較應用方差分析（SNK法行兩兩比較），應用Spearman相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2? 結果

2.1 三組中miR-34b表達比較：觀察組中miR-34b的表達明顯低于對照組和正常對照組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1，見圖1～2。

2.2 觀察組不同臨床特征中miR-34b表達比較：觀察組中miR-34b的表達在有無家族史及不同病變高度的分組中差異有統計學意義（P<0.05）。而在不同性別、年齡及病程的分組中差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 miR-34b與TGF-β1的相關性：免疫組化檢測瘢痕疙瘩中TGF-β1表達的評分為0～7分，相關分析顯示瘢痕疙瘩中miR-34b和TGF-β1具有負相關性（r=-0.53，P=0.018）。見圖3～4。Western Blot檢測瘢痕疙瘩中TGF-β1的表達范圍是1.2～8.1，相關分析顯示瘢痕疙瘩中miR-34b和TGF-β1具有負相關性（r=-0.49，P=0.026）。見圖5～6。

3? 討論

miRNA在細胞內廣泛存在，是一類長度為22bp的內源性非編碼RNA，其能對染色體和遺傳因素進行有效的調控，對發育的間質細胞進行調控[4-5]。miRNA是重要的轉錄后調節因子[6]。miR-34b與腫瘤的侵襲性生長有關，有研究認為瘢痕疙瘩為結締組織腫瘤，具有向周圍正常組織浸潤的作用[7-8]，因此本實驗在選擇miRNA因子時參考病變具有的侵襲性生長的生物學行為，亦參考了TCGA數據庫，篩選到miR-34b可能是與間質異常增殖和間質細胞侵襲生長相關的因子。有研究認為前miR-34b具有莖環結構，經過細胞核及細胞漿內的處理成為成熟的miR-34b[9]。成熟的miR-34b長度約為21～22個核苷酸，有6～7個相同的核苷酸種子序列，種子序列為miRNA與靶mRNA結合的綁定單位，通過與mRNA 3-UTR的互補進而調節下游因子，發揮生物學作用[10]。MiR-34b的靶基因較多，主要是與間質細胞形成相關的因子，如TGF-β1、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）和Ⅳ型膠原等[11]。TGF-β1是目前認為與瘢痕形成相關的重要因子，其高表達對促進纖維母細胞增殖，刺激膠原的合成，誘導纖維連接蛋白的產生有重要作用[12]。研究顯示TGF-β1更多是受基因調控發揮生物學作用的[13]。

本研究結果顯示瘢痕疙瘩中miR-34b的表達明顯下降，提示miR-34b異常表達是病變形成的重要促進因子。本研究發現miR-34b與TGF-β1呈負相關性，且經免疫組化結果和Western Blot結果證實，提示二者具有明確的負向協同作用。TGF-β1是一種分泌型活性多肽，在瘢痕疙瘩的發病過程中發揮著重要的促進作用，尤其是對成纖維細胞的增生，細胞外基質中膠原、蛋白多糖、糖蛋白等過量沉積有明顯作用，膠原纖維排列紊亂也是TGF-β1調節的結果。TGF-β1高表達時可以引起MMP-9表達的下調，對基質的降解作用減弱，細胞外基質和IV型膠原的合成增高[14]。TGF-β1可能是miR-34b下游的靶基因，但是本研究尚不足以證實miR-34b與TGF-β1的靶向關系，后續研究應進行瘢痕細胞系的構建，應用雙熒光素酶報告基因實驗等證實二者的關系。本研究顯示miR-34b的表達在有無家族史及不同病變高度的分組中差別有統計學意義，提示miR-34b低表達預示著遺傳傾向及較高的增殖特征，也預示著較高的復發風險。miR-34b低表達引起纖維細胞繁殖加快，對局部組織的浸潤和侵襲增多。miR-34b可能是促進上皮間質轉化的重要因子[15]。生物信息學顯示miR-34b與MMP-9的3'非翻譯區有一個保守的結合位點，推測MMP-9可能是miR-34b的靶基因，miR-34b在瘢痕中的作用可能與MMP-9有關，這與本研究的結論相仿，主要是TGF-β1可以調控MMP-9在膠原形成中的表達。miR-34b的正常表達狀態是維持上皮和間質形態的重要因子。研究中未發現miR-34b的表達與病程的關系，這顯示出miR-34b低表達狀態對瘢痕形成可能不具有持續性的作用。miR-34b可能具有瘢痕形成中轉錄調節因子的作用，使纖維細胞的凋亡受到抑制，增殖程度改變[16]。但是我筆者推測miR-34b在調節間充質的干細胞多向分化中的作用不大。

總之，瘢痕疙瘩中miR-34b低表達，與家族史及病變增生的高度相關。miR-34b與TGF-β1具有協同負向作用。

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[收稿日期]2019-12-10

本文引用格式：林簡，劉曉紅，王榮坤，等.瘢痕疙瘩中微小RNA-34b的表達及與轉化生長因子-β1的相關性[J].中國美容醫學，2020，29（7）：93-96.