竹葉花椒的石蠟切片方法研究

陳舒憶 唐藝 莫我躍 趙應梅 陸雅麗

摘 要

目的：用石蠟切片法對竹葉花椒的顯微組織結構進行研究，為竹葉花椒的生藥學鑒定和質量標準研究提供依據。方法：以石蠟為包埋劑，通過浸泡、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、貼片等，制備竹葉花椒的石蠟切片，并進行顯微觀察。結果：竹葉花椒顯微組織結構明顯，具有色素塊、油室、草酸鈣簇晶、薄壁細胞等顯微特征。結論：該方法可得到染色清晰、組織結構完整的竹葉花椒的石蠟切片，可作為竹葉花椒生藥學鑒定和質量標準研究的重要方法。

關鍵詞

竹葉花椒;石蠟切片;生藥學鑒定;質量標準

中圖分類號： TS264.3;O657.72 ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼： A

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2020.16.080

竹葉花椒（Pericarpium Zanthoxyli Armati）是蕓香科植物花椒屬（Rutaceae zanthox ylum）竹葉花椒（Zanthoxylum armatum DC.）的干燥成熟果皮[1]，又名竹葉椒、狗椒、崖椒等。自古就是西南地區常用的中藥材和香料，有麻刺感和辛辣味，具有溫中理氣，祛風除濕，活血止痛等功效[2，3]。現有的栽培品種如“九葉青”、“頂壇花椒”等，均為竹葉花椒。研究表明，竹葉花椒的抗炎、抗菌、鎮痛、抗氧化、殺蟲、抑菌等現代藥理作用與其含有的揮發性、生物堿、木脂素以及黃酮類成分有關[4，5]。

竹葉花椒干燥果皮直徑為4～5mm，較難進行徒手切片，而石蠟切片能夠清晰完整的研究其組織結構，并能長期保存。通過對竹葉花椒橫切面的顯微特征研究，為其生藥學鑒定和質量標準研究提供科學依據。

1 材料和儀器

1）材料：新鮮竹葉花椒，采集于貴州貞豐、貴州遵義、貴州凱里等地。

2）儀器設備：Leica DM2500光學生物顯微鏡;Leica RM2245半自動輪轉切片機;天津泰斯特202-3AB電熱恒溫干燥箱。

3）試劑試藥：切片石蠟（天津市科密歐化學試劑有限公司，熔點51℃～55℃），無水乙醇、95%乙醇、冰醋酸、甲醛、二甲苯、番紅、固綠等均為分析純。

2 方法

2.1 取樣與固定

挑選形態完好的新鮮竹葉花椒，將其椒目與果皮剝離，將果皮一切為二，浸入70% FAA固定液（70%的乙醇90ml，冰醋酸5ml，37%甲醛5ml）中固定至少24小時。

2.2 脫水與透明

經固定后的竹葉花椒依次在不同濃度的乙醇中逐級脫水，乙醇濃度按順序依次為70%、80%、90%、95%、100%，各級停留1小時，最后的無水乙醇應至少更換兩次以便于去除水分。脫水后先用無水乙醇-二甲苯（1：1）浸泡1小時;再用二甲苯浸泡1小時，反復2次以除盡乙醇。

2.3 滲蠟與包埋

用石蠟逐步替換透明劑，滲透到果皮組織中。倒出部分浸泡竹葉花椒的二甲苯，加入少許石蠟，置于65℃恒溫箱中，待石蠟熔化后浸蠟。每隔30分鐘倒出原有石蠟，加入新石蠟，反復3次，置換成純石蠟后在恒溫箱中放置6小時，使石蠟充分浸入樣品中。將竹葉花椒樣品放入切片模具中，倒入已熔化的石蠟，迅速冷卻凝固。

2.4 切片與貼片

將模具固定在切片機上，調整切片厚度進行切片，切下的薄片連成蠟帶。在載玻片上滴加蒸餾水，將切好的蠟片在載玻片上展開，利用水的張力可使蠟片伸展平直，待完全展平后，可將切片位置撥正，待水分烘干后蠟片會粘貼于載玻片上，再置50℃烘箱中烘干。

2.5 脫蠟、染色與封片

將載玻片放入二甲苯中至石蠟完全溶解，而后用番紅-固綠二重染色法進行染色，依次放入二甲苯→二甲苯→50%二甲苯（二甲苯：乙醇=1：1）→無水乙醇→90%乙醇→80%乙醇→70%乙醇→60%乙醇→番紅染色→60%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→固綠染色→90%乙醇→無水乙醇→無水乙醇→50%二甲苯→二甲苯→二甲苯→封片，每級二甲苯和乙醇的停留時間為3分鐘，番紅中停留1小時，固綠中染色2分鐘[6，7]。染色后的載玻片滴加中性樹脂封藏劑，放上蓋玻片，烘干后即得永久切片。

3 結果

顯微組織結構特征[8]：竹葉花椒果皮切面為具疣狀突起的圓環形。外果皮為1列扁平細胞，外披角質層，其下有1～3列下皮細胞，內含色素塊;中果皮多為薄壁細胞，可見油室及草酸簇晶，并有少量的方晶及圓形淀粉粒，維管束散在，油室圓形或橢圓形（直徑0.5～1mm）;內果皮為切向延長的薄壁細胞。如圖1所示。

4 討論

石蠟切片法是植物組織鑒定的常用方法，其優點可應用于大部分藥材，能把樣品切成均勻、連續的薄片，觀察植物組織較為完整清晰，并能永久保存，缺點在于實驗操作復雜煩瑣，制作切片的周期較長，不能用于快速鑒別。在竹葉花椒的石蠟切片制作過程中，由于果皮硬度較大，溶液不易滲入，新鮮的竹葉花椒能制作出效果更為良好的石蠟切片。在染色劑的染色時間上，番紅不易染色，至少需要停留1小時，如有需要可放置更長時間，而固綠染色較快，最好不要超過3分鐘，否則，切片染色效果不佳。本文對竹葉花椒石蠟切片的研究較為深入，通過一系列操作，可得到組織完整，細胞界限清楚的植物組織，為竹葉花椒質量標準的制定提供參考依據。

參考文獻

[1]湖南省食品藥品監督管理局.湖南省中藥材標準（2009年版）[M].湖南：湖南科技出版社，2010.

[2]陳茜.竹葉花椒質量標準研究[D].成都：成都中醫藥大學，2019.

[3]程友斌，王慶林，楊茹.竹葉椒的研究進展[J].安徽醫藥，2011，15（1）：11-13.

[4]唐小鳳.竹葉椒的化學成分研究[D].蘭州：蘭州理工大學，2016.

[5]樊丹青，劉友平，陳鴻平.花椒本草考證[J].中藥與臨床，2013，4（6）：59-61.

[6]趙中振，陳虎彪，中藥顯微鑒定圖典[M].福州：福建科學技術出版社，2016.

[7]曹蔚，薛美玲，謝艷華，等.椒目種皮的石蠟切片制備方法及顯微鑒別研究[J].陜西中醫，2012，33（3）：352-354.

[8]熊泉波，施大文.花椒及其同類品的形態組織學研究[J].藥學學報，1991，26（12）： 938-947.