工業大麻提取物中四氫大麻酚定量檢測方法研究

張 景，孫武興，王曙賓，徐云云

(1.漢義生物科技(北京)有限公司 生命科學研究院，北京 100176；2.昆明醫科大學第一附屬醫院，云南 昆明 650032)

1 引言

大麻(CannabissativaL.)，又名火麻、漢麻、線麻、胡麻、野麻，為桑科一年生草本植物[1]。大麻在中國的種植歷史悠久，大麻中含有大麻酚類化合物及其衍生物、黃酮及其苷類、生物堿類、香豆素類、萜類及甾醇類、脂肪酸類、菲類等多種化合物[2]。由于大麻中含有一種精神活性物質四氫大麻酚(THC)，1961年聯合國《麻醉品單一公約》(Single Convention on Narcotic Drugs) 將大麻列入違法麻醉品行列。美國的《麻醉品控制法案》《聯邦列管物質法案》(Controlled Substances Act)規定大麻是毒品。《禁毒法》規定大量買賣大麻為嚴重的犯罪行為。我國1990年全國人大頒布《關于禁毒的決定》，將大麻明確列入毒品[3]。

大麻植物有很高的經濟和藥用價值，現代藥理學研究表明，大麻具有鎮痛，治療青光眼、抗驚厥、抗惡心、治療多發性硬化癥，削弱恐懼性記憶等作用[4～10]。美國FDA于2018年6月25日批準GW Research Ltd．公司的Epidiolex(cannabidiol，大麻二酚)口服液用于年齡在2歲及以上的Lennox-Gastaut綜合征(Lennox-Gastaut syndrome)和Dravet綜合征(Dravet syndrome)患者治療使用。Lennox-Gastaut綜合征和Dravet綜合征是兩種罕見但非常嚴重的癲癇病。Epidiolex是FDA批準的首種含有大麻提取物成分的藥物，也是 FDA 批準的首種用于治療Dravet綜合征的藥物[11]。

近年來，隨著大麻“合法化”爭議越來越大，大麻在某些情況下被允許種植和使用。但為防止大麻被利用為毒品，歐美國家對工業用大麻進行了明確的界定，按照THC含量把大麻分為藥用型(THC>5 g/kg)、中間型(3 g/kg

2 儀器與試劑

2.1 實驗儀器

高效液相色譜儀(LC-16，日本島津公司)；電子天平(SQP，北京賽多利斯科學儀器有限公司)。

2.2 實驗藥材與試劑

四氫大麻酚(THC)對照品(產品批號：FE08221804，純度：99.39%，濃度：1 mg/mL，規格：1 mL，)，購于SIGMA-ALORICH。甲醇、乙腈為色譜純(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)，怡寶純凈水，甲酸為分析純。工業大麻提取物(棕黃色至棕黑色的粉末)為本課題組自制共10批(批號：191223-1、191223-2、191223-3、191226-1、191226-2、191226-3、191230-1、191230-2、200102-1、200102-2)。

3 方法

3.1 色譜條件

采用Welch XB-C18色譜柱(4.6×250 mm、5 μm)，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，線性梯度(0～30 min，25% A；30～30.5 min，25%～5% A；30.5～50 min，5% A；50.5～60 min，5%～25% A)，流速為1.0 mL/min，檢測波長220 nm，柱溫30℃，進樣量10 μL。色譜圖見圖1，四氫大麻酚與前后峰均達到基線分離。

圖1 HPLC色譜圖

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液的制備

取四氫大麻酚對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每1 mL含四氫大麻酚10 μg的溶液，即得。

再用甲醇稀釋至一系列濃度的對照品溶液(濃度分別為：0.10、0.30、0.50、0.99、1.99、9.94 μg/mL)。

3.2.2 供試品溶液的制備

取本品約2 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm的微孔濾膜，取續濾液，即得。

3.3 線性關系考察

精密吸取3.2.1節的各濃度對照品溶液10 μL，在“3.1”色譜條件下測定，記錄峰面積，進行回歸分析，繪制標準曲線見表1。

表1 四氫大麻酚標準曲線

3.4 精密度實驗

精密吸取對照品溶液(9.94 μg/mL)，照3.1節色譜條件重復進樣6次，測對照品峰的面積，計算精密度，所得四氫大麻酚峰面積的RSD值為1.93%。見表2，結果顯示，精密度良好。

表2 精密度實驗結果

3.5 穩定性試驗

取室溫放置的同一供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、16、20、24 h，按3.1節中色譜條件進樣，測定四氫大麻酚的峰面積，所得四氫大麻酚的峰面積的RSD值為2.32%，見表3，結果表明，供試品溶液在室溫下24 h內穩定性良好。

表3 穩定性實驗結果

3.6 重復性試驗

取同一供試品按3.2.2節條件制備6份供試品溶液，按3.1節色譜條件進樣測定峰面積，所得四氫大麻酚峰面積的RSD值為2.18%，表明方法的重復性良好。結果見表4。

表4 重復性實驗結果

3.7 加樣回收率試驗

稱取已知含量的工業大麻提取物9份(每份1.0 g)，分為低、中、高三組(n=3)，分別加入約四氫大麻酚含量的50%、100%、150%的各對照品。按3.2.2節條件制備供試品溶液，按3.1節色譜條件進樣測定峰面積，計算回收率，結果見表5。

表5 四氫大麻酚的加樣回收率

4 實驗結果

精密稱取工業大麻提取物樣品，每份約2 g，精密稱定，按3.2.2節條件制備供試品溶液，按3.1節色譜條件進樣測定峰面積，以外標法計算含量，結果見表6。

表6 樣品中四氫大麻酚的含量

5 討論

DAD全波長掃描顯示THC在211 nm處有最大吸收，考慮到末端吸收的影響，再結合文獻中有關THC檢測波長報道和《工業大麻品種類型》云南省地方標準DB53 295.1-2009，將檢測波長定為220 nm。

比較了不同柱溫(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，不同流速(0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min)，不同的流動相B起始比例(70%、75%、80%)，不同品牌色譜柱(Diamonsil、Welch、Agilent)下檢測結果無顯著差異，所建立方法的耐用性良好。

由表5中的含量測定結果可知，本課題組所制備的工業大麻提取物中四氫大麻酚的含量為13～20×10-6，含量極低，本課題組提取、分離、純化大麻有效部位，去除四氫大麻酚的工藝成熟，為下一步大麻相關產品的開發提供了安全保障。

在國外早已興起大麻的多樣性研究，相關藥品、食品、保健品、化妝品等相繼問世，在我國大麻多樣性產品開發相對空白，還有巨大的空間亟待研究。隨著國際上工業大麻逐步合法化的進程，瑞士、加拿大、智利等國家已經制定了大麻及其制品的THC限量標準及相關法律,而我國尚未出臺關于工業大麻提取物中THC的限量標準以及檢測標準，本研究建立工業大麻提取物中四氫大麻酚定量檢測方法，方法的精密度、穩定性好，靈敏度高，為更好地控制工業大麻及相關產品質量提供依據。