外源MeJA對低溫脅迫下冬小麥冷響應基因表達的影響

樊曉培，邢津溥，魏鐵鎖，李欣洋，蒼 晶，徐慶華，張 達

(東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

低溫限制著植物的地理分布、生長發育。冷馴化有助于提高植物的冷凍耐受性，CBF(C-repeat binding factor)可響應冷信號，是高等植物冷馴化的一個重要途徑。ICE1(inducer of CBF expression, CBF表達誘導因子1)是誘導CBF表達的MYC(Myelocytomatosis)類轉錄激活因子，在低溫時可以特異性地結合到CBF啟動子的MYC識別序列，激活CBF的轉錄，然后結合到其下游靶基因啟動子的DRE(dehydration response element)序列上，誘導下游冷響應基因(Cor)的表達，從而提高植株的抗凍性[1]。

茉莉酸(JA)作為一種信號分子，參與擬南芥的根系生長、花青素積累、毛狀體起始、雄性育性、葉片衰老以及對生物和非生物脅迫等反應[2]。研究表明，JA正調節擬南芥ICE-CBF途徑，以增強其抗凍性；JA提高抗寒性的機制與低溫誘導的冷馴化有關[3]。正常條件下，JA信號阻遏因子JAZ(Jasmonate ZIM-DOMAIN)蛋白通過阻遏ICE1的轉錄，抑制下游冷應答基因的表達；冷脅迫增加了擬南芥內源JA含量，JA以活性形式JA-Ile(茉莉酸-異亮氨酸)與COI1(coronatine insensitive 1)受體結合，JAZ蛋白被降解，從而解除對MYC2、ICE1的阻遏，激活冷應答通路CBF/DREB1基因表達；外源JA提高了擬南芥CBF/DREB1通路冷響應基因的表達量，增強了其抗寒性；相反，阻斷JA生物合成或信號轉導途徑，則會導致植物對冷凍敏感[3]。研究也表明，MeJA處理提高了低溫脅迫下枇杷(EriobotryajaponicaLindl.)脯氨酸、可溶性糖含量及抗氧化酶活性，這些保護物和保護酶能夠減少自由基對細胞膜的損害，保證細胞膜的完整性，從而提高植物的抗寒性[4]。

東農冬麥1號(Dn1)是強抗寒冬小麥品種，外源MeJA可以提高Dn1在低溫脅迫下的抗寒相關指標及JA信號轉導途徑關鍵基因TaCOI1、TaMYC2的表達量，提高其抗寒性[5]。JA對Dn1抗寒性的調節，是否與ICE介導的CBF途徑有關？JA是否引起CBF下游冷響應基因表達量的變化？本課題組前期對Dn1的蛋白組學研究發現，低溫脅迫下，4個冷響應基因Wcor14、Wcor15、Wcor18、Wcor413編碼的蛋白表達水平發生了顯著變化[6]。本研究擬探討外源MeJA處理對低溫脅迫下Dn1上述四個冷響應基因和TaICE41的表達量的影響，結合TaICE41生物信息學分析及預測，進一步探究激素JA調控Dn1強抗寒性的分子機制，為激素調控植物的抗寒性提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與設計

強抗寒性冬小麥品種東農冬麥1號(Dn1)，在黑龍江地區返青率高達85 %，由東北農業大學小麥室提供。2017年9月8日，將Dn1種子播種于東北農業大學校內實驗田內(行長4 m；行距 0.2 m;播種深度5 cm)。常規水肥管理。2017年9月24日，用1 mmol·L-1MeJA噴灑三葉期幼苗葉片，以噴灑等量含相同濃度乙醇的蒸餾水作為對照。以課題組前期確定的四個溫度節點為取樣時間點，待連續10 d每日最低溫度達到5 ℃(2017年10月7日)、0 ℃(2017年10月24日)、-10 ℃(2017年11月21日)和-25 ℃(2018年1月14日)時，于上午(9：00-11：00)取葉片和分蘗節，用去離子水清洗后，剪成1 cm小段，用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和實時熒光定量PCR分析

采用Trizol法提取Dn1分蘗節及葉片總RNA；采用一步反轉錄法合成cDNA第一條鏈，方法參照試劑盒(北京全式金AT311)說明書進行。使用Primer Premier 6.0 軟件設計TaICE41(GenBank ID:EU562183)、Wcor14(GenBank ID:FJ605270)、Wcor15(GenBank ID:KP266692)、Wcor18(GenBank ID:AB097412)、Wcor413(GenBank ID:AAB18207.1)的qRT-PCR特異引物，以小麥TaActin為內參基因，引物序列見表1。按照TransStart Top Green qRT-PCR SuperMix說明(北京全式金AQ131)反應體系進行qRT-PCR反應，反應系統為Mx3000p Real-Time PCR Systerm(美國，Strata gene)。反應程序為94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40個循環;94 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，94 ℃變性15 s。采取2-△△Ct法計算待測基因的相對表達量。3次生物學重復，數據統計學分析采用SPSS 22軟件。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2TaICE41生物信息學分析及預測

TaICE41氨基酸和核酸序列由NCBI搜索獲得。利用Ensembl Plants Home對TaICE41染色體位置進行確定；利用http://web.expasy.org/protparam/在線程序對TaICE41蛋白的PI、MW、氨基酸組成、消光系數、穩定系數等理化性質進行分析；通過ProtComp 9.0(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan& group=programs&subgroup=proloc)在線程序對TaICE41蛋白進行亞細胞定位預測；運用SOPMA SECONDARY STRUCTURE PREDICTION METHOD(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和SWISS-MODEL(https://www.swissmodel.expasy.org/)在線程序預測TaICE41蛋白的二、三級結構；利用MEGA 6軟件N-J法構建小麥與其他6個物種的ICE蛋白系統進化樹并分析，利用MEME-Submission form(http://meme-suite.org/tools/meme)在線程序對小麥及其他6個物種的ICE motif基序進行分析。

2 結果與分析

2.1 外源MeJA對Dn1分蘗節及葉片冷響應基因表達量的影響

2.1.1 對TaICE41表達量的影響

如圖1所示，隨著溫度的降低，Dn1分蘗節和葉片中TaICE41的相對表達量均呈先升后降的變化趨勢，分別在-10 ℃和0 ℃達到峰值。外源MeJA處理顯著提高了Dn1分蘗節在-10 ℃、-25 ℃下TaICE41的表達量(P<0.05)，處理組分別約為對照組的3.3倍、3.4倍(圖1A)；顯著提高了Dn1在0 ℃、-10 ℃和-25 ℃下葉片中TaICE41的表達量(圖1B)。表明TaICE41的表達受低溫脅迫影響，TaICE41參與了Dn1的抗寒響應。

圖柱上不同字母表示差異在0.05水平顯著。

2.1.2 對分蘗節中Wcor14、Wcor15、Wcor18、Wcor413相對表達量的影響

如圖2所示，隨著溫度的降低，Dn1分蘗節中Wcor14、Wcor15、Wcor18和Wcor413的相對表達量在處理組和對照組中均呈先升后降的變化趨勢，分別在-10 ℃、0 ℃達到峰值。在-10 ℃、-25 ℃脅迫時，外源MeJA處理較對照顯著增加了Dn1分蘗節中Wcor14、Wcor15、Wcor18和Wcor413(-25 ℃除外)的相對表達量(P< 0.05)。

*和**表示對照與MeJA處理間差異在0.05和0.01水平顯著。下同。

2.1.3 對葉片中Wcor14、Wcor15、Wcor18、Wcor413相對表達量的影響

如圖3所示，隨著溫度的降低，Dn1葉片中Wcor14、Wcor15的相對表達量在處理組和對照組中均呈升-降-升的變化趨勢，最大值出現在 0 ℃；Wcor18呈持續上升、Wcor413呈先升后降的變化趨勢，分別在-25 ℃、-10 ℃達到最大值。外源MeJA處理顯著提高了Dn1在0 ℃、-10 ℃、-25 ℃下葉片中Wcor14、Wcor15的相對表達量；提高了0 ℃、-10 ℃、-25 ℃下Wcor18的相對表達量，但差異不顯著；提高了 0 ℃、-10 ℃下Wcor413的相對表達量。

*:P<0.05;**:P<0.01

2.2 TaICE41的生物信息學分析及預測

2.2.1TaICE41基因結構及編碼蛋白理化性質

檢測到TaICE41基因全長為1 627 bp，編碼383個氨基酸，位于小麥基因組3A染色體684290168～684290834(TraesCS3A02G442200)上。其保守結構域位于第191～253個氨基酸處，全長63個氨基酸。TaICE41屬于小麥CBF轉錄激活因子成員之一，蛋白分類屬于HLH超家族和類ACT_UUR-ACR超家族成員。ExPASyProtParam tool在線分析顯示，該蛋白的分子質量為39.6 kDa，理論等電點(PI)值為5.04，屬弱酸性；不穩定指數為63.35，脂肪指數為 71.98，親水性平均值為-0.178，為不穩定親水性蛋白。

2.2.2 TaICE41蛋白亞細胞定位預測

采用ProtComp 9.0在線程序對TaICE41編碼的蛋白進行亞細胞定位預測，該蛋白為分泌型蛋白質，定位于細胞核上(如圖4)。

圖4 TaICE41蛋白亞細胞定位預測

2.2.3 TaICE41蛋白二、三級結構預測

TaICE41蛋白二級結構預測結果(圖5左)顯示，無規則卷曲(Coils)占47%，α-螺旋(Helix)占42.30%，延伸鏈占7.05%，β-轉角(Turns)占3.66%，表明該蛋白為無規則卷曲型。

為深入了解TaICE41的蛋白特性，通過同源建模SWISS-MODEL分析系統在線預測TaICE41三維模型如圖5右，發現構建模板蛋白為5gnj.1.B，TaICE41與模板的氨基酸序列同源性為57.69%，低聚糖狀態為同源二聚體，GMQE(Global Model Quality Estimation)值為0.09，QMEAN值為1.06。

圖5 TaICE41蛋白二(左)、三(右)級結構預測

2.2.4 ICE蛋白系統進化樹及Motif分析

利用MEGA6軟件的N-J法對Dn1(Triticumaestivum)、節節麥(Aegilopstauschii)、傘穗山羊草(Aegilopsumbellulata)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)7個物種的ICE蛋白序列進行系統發育分析。結果(圖6)表明，Dn1的ICE41蛋白與節節麥和傘穗山羊草的ICE1蛋白相似性為94%；與二穗短柄草相似性為88%。用MEME在線程序對7種植物的motif進行分析(圖7)發現，小麥與節節麥和傘穗山羊草的ICE1蛋白有10個相同的motif基序，而與大豆、水稻、擬南芥有7個相同的motif基序，進一步驗證了蛋白進化樹分析結果。

圖6 不同物種ICE蛋白系統進化樹分析

圖7 不同物種ICE蛋白motif分析

3 討 論

在水稻、擬南芥、西紅柿、黃瓜、煙草、巴西橡膠、香蕉和麻風樹等植物中，ICE可提高其抗寒性[7]。Hu等[3]發現，低溫提高了擬南芥JA合成基因的表達，JA通過正調節ICE-CBF途徑增強其抗凍性。Hong等[8]發現，低溫處理橡膠樹 12 h可提高其內源JA生物合成關鍵基因OPR、AOS、AOC和JA信號通路重要基因JAZs和MYCs的表達。JA正調節巴西橡膠樹的冷響應，HbICE1正調節其耐寒性[8]。冷馴化能夠提高TaICE41基因在擬南芥中的表達，其結構域與MYC2a和MYC4g互作，可激活CBF轉錄，提高植株的抗凍性[9]。本研究發現，與5 ℃相比，0 ℃、-10 ℃、-25 ℃低溫均不同程度地提高了Dn1分蘗節和葉片中TaICE41的表達量；JA處理顯著提高了上述低溫脅迫下分蘗節與葉片中TaICE41的表達量，表明Dn1的TaICE41表達量受低溫脅迫影響，TaICE41參與了Dn1的抗寒響應。這與前人對擬南芥[3]、橡膠樹[8]ICE1正調控耐寒性的研究結果一致。擬南芥ICE1基因編碼494個氨基酸的蛋白質，分子量為53.5 kD，AtICE1蛋白含螺旋-環-螺旋(bHLH)保守結構域[10]。小麥TaICE41和TaICE87蛋白與AtICE1蛋白分別有50%和47%的同源性，TaICE41和TaICE87一致性為46%[9]。本研究表明，冬小麥Dn1的TaICE41位于3A染色體上，定位于細胞核內，屬于小麥CBF轉錄激活因子成員之一，蛋白分類屬于HLH超家族成員。Dn1的TaICE41蛋白與節節麥和傘穗山羊草的ICE1蛋白在系統進化樹上屬于同類，相似性為94%，motif基序有10個相同，支持聚類分析結果。

低溫脅迫誘導了編碼COR蛋白的基因表達，這與植物抗寒性正相關。擬南芥Cor的順式作用元件CRT(C-repeat)/DRE的CCGAC核心基序在啟動子功能中起關鍵作用[11]。AtCor蛋白起到穩定細胞膜結構、激活ROS清除系統、產生抗冷凍蛋白和代謝物的作用，進而提高植物對冷凍脅迫的耐受性[12-13]。Wcor14和Wcor15類似于擬南芥COR15a，編碼葉綠體COR蛋白，為ABA非依賴型COR[14]。4 ℃冷馴化3～6 h后，小麥葉片Wcor14基因的相對表達量迅速積累，在第三天達到最大值，隨后下降并維持在一個穩定的水平，表明Wcor14受低溫誘導[15]。對小麥進行4 ℃處理，發現處理15 min后冬小麥和春小麥幼苗葉片Wcor15基因的表達量提高，隨后表達量持續增加, 并在2 d內維持較高的水平；若幼苗進一步暴露在更低的溫度，則導致其表達水平降低[16]。wcor18蛋白屬于高度保守的磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族，該家族成員與控制單、雙子葉植物的開花時間有關[17]。對4 ℃處理的冬小麥葉片進行蛋白雙向電泳與質譜鑒定發現，低溫誘導了wcor18蛋白的表達，參與冷誘導的蛋白同時也參與春化起始的過程[18]。-5 ℃處理顯著增加了冬小麥葉片Wcor413蛋白的表達水平[19]。

本研究發現，低溫脅迫下Dn1分蘗節和葉片中CBF下游冷響應基因Wcor14、Wcor15、Wcor18、Wcor413的表達量均不同程度地提高，表明這些基因受低溫誘導,這與對擬南芥[3]和橡膠樹[8]、小麥[15-16,18-19]的研究結果相一致。

前人對冬小麥冷響應基因受低溫脅迫誘導表達的研究，多為室內培養箱[15，18-19]或水培[16]培養，檢測部位多為葉片[15-16,18-19]，處理溫度為 4 ℃[15-16,18]、最低溫度為-5 ℃[19]，多為低溫脅迫后的快速響應。而自然界的生長環境相對復雜，植物在自然生長條件下受到低溫、光照、水分、土壤條件等多種因素的影響，且抗寒性是在持續低溫適應過程中逐漸形成。有報道指出，-5 ℃處理下，冬小麥葉片中的很多基因在第1天內迅速誘導表達，至第3天達到最大，如Wcor413基因的相對表達量第3天是第1天的8倍，WCOR14a基因的相對表達量第3天是第1天的2倍；也有一些基因，僅在低溫脅迫后1 d內誘導表達[19]。Rinaldueei等[18]指出，4 ℃處理后，冬小麥葉片Wcor18蛋白的表達量隨時間延長而增加，第63天達到最大，Wcor18基因的相對表達量結果與之一致。本研究發現，隨著溫度的降低，分蘗節中5個被測冷響應基因的表達量均在-10 ℃達到最大值，說明-10 ℃是Dn1越冬的重要溫度節點，-25 ℃作為生存的極限溫度可引起植物體內很多代謝停止，故表現出基因表達量降低，這與前人的研究結果相一致[18-19]。葉片中除Wcor18外，其他4個冷響應基因表達量均在 0 ℃最大，這是因為葉片在極低溫度下被積雪覆蓋或被寒風抽干，代謝減弱，表達量降低。分蘗節與葉片相比，除Wcor18外，TaICE41、Wcor14、Wcor15、Wcor413均表現出分蘗節>葉片，這與分蘗節作為Dn1安全越冬的主要部位有關。本研究基于大田自然降溫條件，更能反映植物的自然生長狀態，故研究結果對解決高寒地區農業生產實踐具有更直接的參考價值。我們前期構建了低溫脅迫下(5 ℃、0 ℃、-10 ℃、-25 ℃)Dn1分蘗節蛋白組庫，組學分析發現，與5 ℃相比，-10 ℃下的冷響應蛋白Wcor14、Wcor15、Wcor18、Wcor413的表達量顯著上調[6]。本研究中，冷響應基因表達水平的變化與蛋白組的變化相一致。結合外源MeJA處理提高了低溫脅迫下Dn1葉片及分蘗節中TaMYC2的表達量[5]，表明JA可能參與低溫脅迫下Dn1的ICE-CBF途徑。綜合本課題組前期SA[20]、ABA[21]對Dn1效應的研究結果，推測ABA、JA、SA與ICE-CBF信號途徑在Dn1強抗寒的分子機制中存在協同作用。

ICE蛋白的活性受HOS1泛素E3連接酶的負調控，HOS1靶向ICE蛋白酶體降解[22-24]；JA信號阻遏蛋白JAZ1/4抑制ICE1轉錄活性[3]。因此，ICE1不僅是冷信號的核心組件，也是一個整合多種信號調節植物的耐寒性的關鍵點。那么，Dn1的TaICE41蛋白是否與MYC2、JAZ蛋白互作？JA如何介導Dn1的ICE-CBF抗寒途徑？這有待于進一步研究。