鎘砷在線蚓中的毒物-毒效動力學過程及定量模擬

李 敏，龔 冰，黃雪瑩，肖 雪，何爾凱*，仇榮亮

（1.中山大學環境科學與工程學院，廣州510006；2.上海交通大學環境科學與工程學院，上海200240；3.廣東省環境污染控制與修復技術重點實驗室，中山大學，廣州510006；4.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，華南農業大學，廣州510642）

隨著人類社會經濟的快速發展，土壤重金屬污染形勢日趨嚴峻，在導致土壤環境產生污染的元素中，重金屬鎘（Cd）、類金屬砷（As）問題尤為突出，已引起人們的廣泛關注[1]。環境中的Cd主要來源于核工業、農業、電鍍及化工領域[2]，As 主要來源于采礦、冶煉及化石燃料的燃燒[3-4]，這些人為來源產生的Cd、As大量進入水體和土壤中，對生態環境造成潛在危害。在自然界中過量的Cd、As等毒性元素不可降解，被生物吸收后會在其體內不斷累積，根據毒性閾值假設（Critical body residue，CBR），當累積濃度達到元素的毒性閾值時就會誘導產生相應的毒性效應[5]。研究發現，Cd 污染會抑制米氏凱倫藻細胞的增長[6]，造成玉米、黃瓜葉片發黃、生長緩慢[2]。As 污染會對淡水魚的皮膚造成損傷，引起肌肉萎縮惡化[7-8]，As進入人體后還會蓄積在甲狀腺、腎以及頭發等處，對人體健康造成嚴重危害[9]。

以往對金屬的毒理學研究多關注某一固定暴露時間下對生物體的毒性效應，以此確定污染物的生態風險。然而研究顯示污染物在生物體內的累積過程具有時間依賴性，導致毒性效應會隨暴露時間而變化[10]。Zhang 等[11]研究發現隨著時間的增加，鉛（Pb）暴露下線蚓的存活率明顯下降；He 等[12]研究表明隨著暴露時間的增加，金屬鎳（Ni）對線蚓的半數致死濃度（LC50）逐漸變小。由此可見，基于急性毒性結果往往不能全面反映污染物的長期暴露風險。因此，為準確評估不同時間尺度下的生態風險，有必要深入開展Cd、As的動態毒性效應研究，建立健全重金屬污染土壤風險評估和環境質量標準體系。利用毒物毒效動力學模型（TK-TD）可以同時考慮暴露濃度與暴露時間的影響，從而闡明污染物在生物體內的累積和毒性作用過程[13-14]。毒物動力學描述了污染物在暴露期間從體外進入體內的過程，包括其吸收、分布、生物轉化和排除；毒效動力學過程將體內濃度和毒性作用有機地聯系在一起，描述了時間和毒性響應的關系，包括機體損傷和恢復過程。

除了暴露時間外，生物有效性是影響污染物毒性的另一重要因素。重金屬的環境暴露濃度通常被作為指示毒性效應的暴露劑量，然而金屬的毒性實際是由其被生物吸收并和毒性作用位點結合的部分（即生物有效濃度）決定的[15]。金屬的生物有效性受到環境因素，如：pH 值、環境共存陽離子、有機/無機配體等的影響[16-18]。相較于重金屬的環境暴露濃度，體內濃度考慮了生物吸收過程中環境因素對重金屬生物有效性的影響，因此能更好地指示毒性作用[12，19]。對于進入到生物體內的金屬，生物體也能夠通過調控金屬與毒性作用位點的結合來降低其毒性作用[20]。研究Cd、As在線蚓體內含量與毒性作用的相關性，對理解其生物有效性具有重要意義。

線蚓（Enchytraeus crypticus）屬于環節動物門寡毛綱單向蚓目線蚓科，廣泛分布于多種土壤中，因其生命周期短、繁殖率高、對土壤特性（例如pH值、黏土含量、有機質含量、溫度）的耐受范圍大[21-22]，且對環境脅迫較為敏感，已成為陸生生態毒理學研究的重要模式生物，能夠用以預示土壤的生態和環境健康狀況。在土壤-動物研究體系中，目前對重金屬進入土壤中的環境行為過程已有較多了解，但對于不同時間尺度下重金屬對土壤動物的毒性效應過程認知較少，因此，有必要構建TK-TD 模型定量描述Cd、As 在線蚓中的動態累積和毒性作用過程。

本文以我國污染土壤中常見的Cd、As 為研究對象，典型土壤動物線蚓（Enchytraeus crypticus）為受試生物，采用室內試驗和模型擬合等手段，系統研究Cd、As對線蚓的動態累積和毒性作用過程，從毒物動力學-毒效動力學角度闡明Cd、As毒性作用機制。以期深入了解Cd、As 作用下土壤動物的毒性響應規律和機理，為精準評價Cd、As污染對陸生生態系統的影響提供科學依據和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 受試生物

線蚓（Enchytraeus crypticus）因對重金屬、有機物等化學物質的敏感性而作為模式生物廣泛應用于土壤生態毒理學試驗中[22]。本試驗中的受試生物線蚓取自中山大學環境科學與工程學院，線蚓被置于溫度為20 ℃、相對濕度為75%的黑暗氣候室中，在瓊脂培養基上進行培養和繁殖。每周給其喂兩次燕麥制成的食物。選取同一時期繁殖、長度約為1 cm 且大小相對一致的線蚓成蟲用于毒性試驗，可通過觀測其頭部是否具有白色的生殖環帶來確定其是否為成蟲。

1.2 暴露介質

本研究采用溶液-惰性沙體系作為暴露介質。從河灘采集的沙經自來水不斷沖洗干凈后烘干，用60 目的篩網分選得到顆粒較小的沙粒，隨后置于600 ℃的馬弗爐中燒制3 h 以去除沙中的有機質，待冷卻后用2%～3%的硝酸浸泡0.5 h，以去除有機殘留物及鐵錳的碳酸鹽化合物，浸泡之后用自來水沖洗，洗去殘余的酸，再用去離子水清洗，最后置于60 ℃的烘箱中烘干后即可得到惰性沙。

用含有0.2 mmol·L-1Ca2+、0.05 mmol·L-1Mg2+、2.0 mmol·L-1Na+和0.078 mmol·L-1K+的模擬土壤溶液作為基礎溶液，制備不同濃度的Cd（CdCl2·2.5H2O）、As（Na3AsO4）暴露溶液。用0.75 g·L-1MOPS[3-（N-嗎啉代）丙烷磺酸]和0.75 mg·L-1MES[2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸]pH緩沖液將所有暴露溶液的pH調節至6.0。

1.3 毒性測試

動態累積和毒性測試設置6 個不同的暴露時間：1、2、4、7、10 d 和14 d。Cd、As 的暴露濃度分別設置為：0.04、0.08、0.16、0.20、0.24、0.32、0.40、0.48 mmol·L-1和0.20、0.40、0.80、1.00、1.60、2.00、2.40 mmol·L-1。每個處理設置3 個重復，每個重復稱取20 g 制備好的惰性沙，然后分別加入5.5 mL 配制好的暴露溶液，放置24 h 使其達到平衡即得到模擬土壤溶液體系。待體系平衡1 d 后，選擇10 條線蚓成蟲放入平衡體系中進行毒性暴露[12]。

整個試驗暴露期間均在溫度為25 ℃、相對濕度為75%、光照16 h、黑暗8 h的人工氣候室進行，且在暴露期間每2 d給樣品補充因蒸發作用而失去的水分，確保整個試驗過程中相對穩定的暴露濃度。為避免食物中有機質對金屬形態的影響，在此期間不進行喂食。在每個毒性試驗暴露終點統計線蚓的死亡率，收集存活的線蚓，用高純水清洗數遍，去除線蚓表面殘留的暴露溶液，然后放入-20 ℃的冰箱中保存待測其體內濃度。

1.4 樣品測試及數據分析

將收集到的線蚓樣品冷凍干燥至少48 h，并用微量天平（Mettler-Toledo XPR2U）稱質量，然后轉移到潔凈的玻璃管中，加入HNO3（65%～68%，GR）通過逐步升溫加熱步驟消解線蚓樣品，將玻璃管中的殘留物溶于5 mL HNO3（1%）中，用電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS；NexION 350D；Perkin Elmer）分別測定線蚓體內Cd、As 的濃度。每次消解時需設置2 個空白樣，以確保消解過程中無污染。暴露溶液中Cd、As的濃度由電感耦合等離子體發射光譜儀（ICP-OES，Optima 5300DV，PE）測定，實測的Cd、As 濃度用于進行本研究中所有數據處理和模型擬合。

1.5 毒物動力學-毒效動力學模型

1.5.1 毒物動力學模型

假設化學物質（Cd、As）的濃度在暴露過程中保持穩定，可利用一室模型（One-compartment model）通過吸收速率常數（Ku，mg·kg-1·d-1）和排出速率常數（Ke，d-1）描述Cd、As在生物體中的動態積累過程：

式中：C0（t）是在不同暴露時間下生物體內Cd、As 的濃度，mg·kg-1；Cw是Cd、As 的體外暴露濃度，mmol·L-1。通過公式（1）擬合Cd、As 不同暴露濃度、暴露時間下在生物體內的濃度數據，可以分別得出其吸收速率常數（Ku，mg·kg-1·d-1）和排出速率常數（Ke，d-1）。

1.5.2 毒效動力學模型

不同暴露時間下，線蚓在不同暴露濃度溶液中的存活率可采用log-logistic模型來進行描述：

式中：S（t）是在不同暴露時間下線蚓的存活量；Cw是Cd、As溶液實測暴露濃度（mmol·L-1）或Cd、As的體內濃度（mg·kg-1）；Smax是在暴露濃度下的最大存活數；LC50（t）是不同暴露時間下線蚓的半數致死濃度，mmol·L-1；b是斜率參數。

LC50與暴露時間之間的關系可以用時間-毒性響應方程表示：

式中：LC50∞是指最終LC50值，mmol·L-1；Kd是根據毒性數據得出的毒效動力學過程的損傷速率常數，d-1。

1.6 數據處理與分析

本研究中的模型擬合采用軟件JMP 16.0（SAS Institute）中的求解功能。例如，Cd、As 的吸收和排出速率常數（Ku和Ke），需要利用最小二乘法，通過最小化體內濃度模型預測值和實測值的殘差平方和擬合一室方程得到。

2 結果與分析

2.1 基于一室模型定量描述Cd、As動態累積過程

不同Cd、As暴露濃度下，線蚓體內濃度與暴露時間的關系如圖1 所示?？傮w上，生物體內Cd、As 的累積濃度與暴露濃度和暴露時間呈顯著正相關性。Cd在線蚓體內的濃度隨時間變化不斷升高，而As 暴露下（除最高濃度1.593 mmol·L-1）其體內濃度在暴露4 d 后基本達到平衡狀態。Cd 在線蚓體內的累積濃度顯著高于As，Cd、As體內濃度的最大值分別出現在暴露后的第10 d和第4 d，分別為459.6、32.91 mg·kg-1。

當使用一室模型[公式（1）]擬合不同暴露濃度下線蚓體內的Cd、As含量隨時間變化的關系時，可以得到如表1 所示的不同暴露濃度下Cd、As 在線蚓體內的吸收速率常數Ku和排出速率常數Ke。Cd、As 的Ku值均隨著濃度的增加而呈現降低趨勢，Cd、As的Ku最小值分別出現在暴露濃度為0.338、1.126 mmol·L-1時，分別為1.648、0.063 mg·kg-1·d-1。而Cd、As的排出速率常數Ke值隨暴露濃度的變化無明顯規律。將所有Cd、As 暴露濃度下線蚓的體內濃度數據一同擬合時，得到Cd、As總吸收速率Ku和總排出速率Ke分別為1.761、0.102 mg·kg-1·d-1和0.015、0.287 d-1。

圖1 不同暴露濃度下線蚓體內Cd和As含量隨暴露時間的變化Figure 1 Relationship between body concentration and exposure time in Enchytraeus crypticus exposed todifferent concentrations of Cd and As

表1 基于一室模型擬合得到的Cd、As吸收-釋放動力學參數Table 1 Estimated uptake，elimination parameters of Cd and As by fitting dynamic body concentration to One-compartment model

2.2 基于時間-毒性響應方程描述Cd、As 的動態毒性效應

不同Cd、As 暴露濃度下線蚓的存活率隨著時間的變化趨勢如圖2 所示。在14 d 的暴露時間內，對照組中均未發現生物死亡，隨著Cd、As暴露濃度和暴露時間的增加，線蚓的存活率不斷降低?；隗w外暴露濃度，利用log-logistic 模型得到不同暴露時間下Cd、As 對線蚓的半數致死濃度LC50（表2）。隨著暴露時間的增加，Cd、As 的LC50值分別從0.537 mmol·L-1下降到0.208 mmol·L-1、從1.856 mmol·L-1下降到1.128 mmol·L-1，均在暴露7 d 后基本達到穩定狀態（圖3）。通過比較相同暴露時間下Cd、As的LC50值，可以看出Cd 的毒性強度是As 的3～5 倍。利用時間-毒性響應方程對不同暴露時間下Cd、As的LC50值進行擬合，得到最終半致死濃度LC50∞和損傷速率常數Kd值，Cd、As 的LC50∞值分別為0.314、1.253 mmol·L-1，Kd值分別為0.738、1.077 d-1（表2）。

2.3 基于Cd、As體內吸收預測動態毒性效應

不同暴露濃度和暴露時間下Cd、As 在線蚓中的體內濃度與其相應存活率的相關性如圖4 所示。整體上可以看出，Cd、As的毒性效應隨其體內濃度的增加而不斷加強，相較于Cd，As的體內濃度與毒性效應（存活率）具有更好的相關性（R2=0.75）。利用公式（2）擬合不同Cd、As 體內濃度和毒性數據，得到基于體內濃度的半數致死濃度LC50inter值（表3），Cd、As 的總LC50inter值分別為468.8、26.65 mg·kg-1，說明線蚓體內As 的毒性強于Cd。當分別擬合不同時間點體內濃度與毒性數據時，發現Cd 的LC50inter值隨著暴露時間的增加而上升，而As 的LC50inter值隨著時間基本保持不變。

圖3 基于體外暴露濃度獲得的Cd、As半數致死濃度隨暴露時間的變化Figure 3 Toxic effects（LC50）of Cd and As on Enchytraeuscrypticus with exposure time

圖2 不同暴露時間下線蚓存活率與Cd、As暴露濃度之間的劑量-響應關系Figure 2 Dose-response relationship between Enchytraeus crypticus survival fraction of organisms and exposure concentration of Cd and As under different exposure times

表2 基于體外暴露濃度利用log-logistics方程擬合得到的不同暴露時間下Cd、As半數致死濃度及基于時間-毒性響應方程擬合得到的動態毒性參數Table 2 LC50 values of Cd and As to Enchytraeus crypticus calculated using a log-logistics model and the estimated parametersby fitting LC50 values under different exposure

圖4 不同暴露濃度和暴露時間下Cd、As的體內濃度與存活率的相關性Figure 4 Correlation between survival fraction and the body concentrations of Cd and As under different exposure concentrations and exposure time

3 討論

3.1 重金屬Cd和As在線蚓體內動態累積過程的差異性

已有研究表明，重金屬在生物體內的累積具有濃度依賴性，同時暴露時間也是影響生物體內濃度的重要因素，重金屬的生物累積與劑量和時間呈正相關關系[23-25]。研究發現跳蟲和線蚓體內的Cd、Zn 含量會隨暴露時間增加而不斷升高，并最終達到平衡狀態[26-27]。本研究發現重金屬Cd 和類金屬As 在線蚓體內的累積過程也呈現同樣的趨勢，這表明金屬在生物體中的累積是一個動態過程。本研究利用一室模型來描述金屬在線蚓體內的吸收和排出過程，模型很好地擬合了Cd、As的動態累積數據，表明吸收和排出速率常數可以用來描述環境中不同暴露水平下Cd、As的毒物動力學過程。在本研究中，Cd 的總吸收速率Ku大于As，而排出速率Ke小于As，Cd 在線蚓體內的累積量遠大于As，表明Cd相較于As更容易在生物體內富集。Sheppard 等[28]指出Cd 排出速率低的原因可能是金屬Cd 易與生物體內金屬硫蛋白的結合，導致生物體內Cd 的濃度隨著時間變化呈明顯增加趨勢。同樣，研究發現[29]Cd、As 在枇杷中的累積情況與本研究結果類似，Cd 的生物體內濃度遠大于As 的濃度。而吳慶其[30]研究發現在金針菇培養料中添加Cd（0.1～20 mg·kg-1）和As（0.1～15 mg·kg-1）后，子實體的Cd、As 累積濃度相差不大，這表明不同金屬在不同生物體中累積能力具有差異性。

表3 基于體內濃度利用log-logistics方程擬合得到的不同暴露時間下Cd、As對線蚓的半數致死濃度（LC50inter）Table 3 LC50 values of Cd and As to Enchytraeus crypticus related to body Cd and As concentrations at different exposure timesseparately and all data together

通過一室模型擬合結果發現Cd、As 的吸收速率Ku值隨著濃度增加呈下降趨勢，先前的研究[31]也有相似發現，將蚯蚓暴露于含Cd 10 mg·kg-1和100 mg·kg-1的土壤中時，Cd 的吸收速率常數從0.214 mg·kg-1·d-1降至0.104 mg·kg-1·d-1。Zhang 等[11]和He 等[12]分別研究了Ni 和Pb 在線蚓體內的毒物動力學，發現吸收速率常數在達到峰值后會隨暴露濃度升高而降低。暴露濃度升高導致吸收速率下降一方面可能是受到負責轉運金屬離子的載體的限制，另一方面在金屬高暴露濃度下細胞死亡率增加，進而導致生物對毒物的吸收能力降低[32]。與吸收速率常數Ku相比，排出速率常數Ke在很大程度上取決于受試生物本身，較少受到暴露濃度的影響[33]。

3.2 重金屬Cd和As對線蚓的動態毒性影響區別

重金屬的暴露會顯著降低生物的存活率[34]，而且金屬的毒性會隨著暴露時間的增加而增強，然后達到穩態[10]。本研究結果同樣顯示隨著暴露時間的增加，Cd、As的毒性不斷增強并在7 d后達到平衡。前人研究發現暴露在Pb 中的赤子愛勝蚓的LC50值隨時間增加而降低，最后在21 d 趨于平衡[35]。王順昌等[36]將秀麗線蟲暴露在5 mmol·L-1的砷酸鈉中，發現隨著暴露時間的增加，線蟲的細胞凋亡數目明顯大于對照組，表明As 的毒性效應隨著時間增加而明顯增強。因此，在對Cd、As的生物毒性研究中應該充分考慮時間因素的影響。

本研究發現Cd、As 的損害速率Kd值均大于0，最終半致死濃度LC50∞Cd小于LC50∞As，表明Cd和As均對線蚓產生毒性且Cd 的毒性作用強As。Vellinger 等[37]將淡水魚分別暴露在Cd、As 中240 h 后，發現以存活率為終點的LC50As遠大于LC50Cd，與本研究結果一致。Cd、As 毒性作用的差異可能是由于二者進入細胞的方式和毒性作用機理不同，Reid 等[38]研究發現Cd 會干擾細胞內Ca的運輸和代謝，Cd2+在細胞基底膜水平通過Ca2+-ATPase 或Na+/Ca2+交換的方式進行轉運[39-41]，由于Cd2+和Ca2+的離子形式相似，所以它們可以競爭同一種類型的配體，因此Cd 的二價離子形態具有更高的生物利用度及毒性[42]。As 則通過磷酸鹽轉運系統[43]進入細胞，砷酸鹽可能會干擾電子傳輸鏈或葡萄糖代謝中的磷酸化反應[44-47]，進而阻礙葡萄糖的代謝及能量的產生[48]。

3.3 Cd和As在線蚓體內的累積和毒性的關系

先前的研究表明，體內濃度由于已經考慮了暴露介質及暴露時間對毒物動力學過程的影響，因此相較于體外暴露濃度可以更好地作為動態毒性的指示指標[12，49]。本研究發現基于體內濃度計算得到As 的LC50inter值隨著時間變化整體保持不變，這與之前的研究結果類似[27]。而Cd 的LC50inter值隨著暴露時間的增加不斷變化，而且基于體內濃度表達毒性效應時Cd的毒性強度小于As，這與基于體外濃度得到的毒性作用結果不同。這可能是由于金屬Cd進入生物體后會誘導金屬硫蛋白MT 的產生，而MT 是生物體內重要的解毒物質[50]，Wallace 等[51]研究表明，將草蝦飲食中的Cd 暴露量增加5 倍會導致總Cd 組織濃度增加18 倍，但由于MT 的誘導，其細胞溶質中Cd 的儲存量增加了32 倍。MT 的增加導致更多的Cd 與其結合，進而不斷減弱生物體內Cd 的毒性作用，這也進一步表明Cd 的體內濃度并不能完全代表其生物有效濃度以指示其毒性生物。趙俊杰[52]研究也指出，在Cd暴露下蚯蚓體內MT 含量隨著暴露時間而升高，產生的MT 會不斷與Cd 結合，因此會降低Cd 對生物體的毒性。積累在生物體內的金屬會被生物體通過代謝排出，或分布在不同組織中，從而抑制其與毒性作用位點的結合，這些生物體內部的解毒機制影響了金屬在生物體內累積濃度與其毒性效應的相關性，進而影響體內濃度對金屬毒性效應的有效預測[53]。

累積在生物體內的部分金屬通過與毒性作用位點的結合從而對生物產生毒性。金屬會誘導動物機體產生過氧化氫和自由基等活性氧物質，導致脂質過氧化產物累積，從而破壞細胞膜，造成DNA 損傷并干擾抗氧化防御系統[52，54]。研究發現，魚類受到重金屬Cd 脅迫時，體內會產生大量活性氧（ROS），如超氧陰離子（O-2）、羥自由基（·OH）和H2O2等[55]。如果這些ROS 不能被及時有效地清除，將造成氧化損傷，進而導致魚體內組織和器官的損傷。楊瑞瑛等[56]研究發現累積在大鼠體內的As 主要分布在細胞的微粒體中，這些As會與巰基酶結合使酶失活，干擾細胞的生物功能、結構和正常代謝，其中分布在細胞核中的As會引起DNA 的氧化損傷并抑制抗氧化酶的產生，使得細胞中的過氧化氫（H2O2）蓄積，進而對大鼠產生毒性影響。

目前針對環境污染物的研究主要集中在單一金屬的毒物-毒效動力學過程的描述，在實際環境中金屬大多以混合物形式存在，而有關混合物存在下污染物的累積和毒性作用的動力學過程研究較少，應當充分考慮Cd、As交互作用對其在線蚓體內動態吸收、釋放及毒性作用的影響。此外，現階段的研究手段主要采用室內模擬試驗，研究對象也主要針對單一的生物物種，不能全面反映Cd、As在實際土壤中的生態毒性效應，因此有必要采用微宇宙生態系統方法原位研究金屬毒性影響，并從整個土壤生物群落出發研究污染物對群落結構和多樣性等的影響，從而更全面地評估污染物的生態毒性作用。此外，當前絕大多數的毒理學研究仍是基于生物體在個體水平上對污染物的毒性響應，而對其分子水平的毒性研究仍較為欠缺，為了進一步揭示Cd、As對生物的毒性效應機制，可以利用蛋白組學、代謝組學等多組學聯合手段闡釋Cd、As對生物體分子水平的毒性作用。

4 結論

（1）整體上，Cd 和As 在線蚓體內的含量受暴露濃度和暴露時間的影響，Cd的吸收速率大于As，而排出速率小于As，因此Cd更容易在線蚓體內累積。

（2）當基于外部暴露濃度表達毒性效應時，Cd、As 的毒性效應（LC50）隨暴露時間的增加而不斷增強并最終趨于穩定，Cd對線蚓的毒性效應大于As。

（3）當基于體內濃度表達毒性效應（LC50inter）時，As 的LC50inter值基本不受暴露時間的影響，而Cd 的LC50inter值隨暴露時間的增加持續升高，Cd對線蚓的毒性效應小于As；相較于Cd，As 的體內濃度能更好地預測其對線蚓的動態毒性效應，說明體內累積的Cd不能代表其生物有效濃度以指示其毒性效應。