高羊茅對電動-微生物修復石油污染土壤的影響

孟 欣，李 剛，高 鵬，卞成鵬，郭書海

（1.中國科學院沈陽應用生態研究所，沈陽110016；2.中國科學院大學，北京100049；3.污染土壤生物-物化協同修復技術國家地方聯合工程實驗室，沈陽110016）

電動力學修復有機污染土壤是近年來土壤修復研究的熱點之一。在經歷了單一電動修復、藥劑輔助增強修復后，現已逐步發展到同微生物修復、植物修復等技術聯合應用[1-3]。電動-微生物聯合技術提高修復效率的成效顯著，然而修復過程中電流衰減是該技術的主要限制性因素之一[4]。已有研究報道，電動裝置內種植植物可有效維持系統內電流水平[5]，這對于有機污染土壤修復效果的提高具有重要指導意義。

電動-微生物耦合植物修復技術提高土壤中有機污染物降解效率的可能機制：首先是電場和植物對微生物的影響，電動作用可作為土壤中電子受體、營養物質、外源功能菌的外源驅動力，提高污染物和土壤微生物間的傳質效率，而且適度的電場強度有助于增加微生物的群落多樣性[6]；植物根際可為土壤微生物提供棲息地以及養分，并改善根區的好氧環境，促進根際微生物的繁殖以及對污染物的分解轉化，進而提高修復效率[7]。其次是電場對植物的影響，對模擬及實際污染土壤開展電動-植物聯合修復時發現，適當電場刺激下，植物生物量顯著提高[8]，植物根際的生理學性質及酶活性提高，隨之依賴于植物根際微生物和酶活性的有機污染物降解過程將會加速[9]。

本研究以石油污染土壤為試驗材料，施加直流電場，電場強度為1 V·cm-1。相關報道表明，在此電場強度作用下，微生物的生長繁殖能夠得到促進，菌體數量較大，達到最大菌數所需要的時間較短[10-12]。在污染土壤中種植高羊茅，該植物生長周期短、根系發達且適應性強。已有研究證明其對石油類污染物表現出較好的耐受性[13]，對高濃度（約3.5%）石油烴污染土壤具有良好的修復潛力[14]。向系統內添加石油降解菌，通過研究陰陽極切換電場作用下，植物生長60 d中電動-微生物系統耦合植物修復過程中的主要參數變化，為電動-微生物耦合植物修復技術在大規模場地應用中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設計

供試土壤采自中國科學院沈陽應用生態研究所試驗站周邊農田表層土，將土壤晾干后除去植物殘渣及其他非土壤成分，研磨后過2 mm 網篩備用。將取自遼河油田的原油溶于三氯甲烷溶劑，與土壤混合均勻，控制土壤總石油烴含量在3%，每日攪拌2～3 次，直到兩周后土壤中三氯甲烷揮發完全，儲存備用。測得土壤理化性質如表1所示。

土壤中投加的微生物為本實驗室前期篩選富集的12種高效石油降解菌。將12種菌懸液按菌量等比例混合，將混合菌懸液均勻噴灑至滅菌后的土壤中并混合均勻，保持土壤含水率在23%左右，土壤中菌體最終濃度為1.0×108CFU·g-1。

試驗所用高羊茅種子購自日出種業。將混入菌液的模擬污染土壤每份稱取5.5 kg 并分別放入PVC植物培養槽中（280 mm×190 mm×150 mm），每個槽中取出適量土壤備用，后用噴壺在培養槽土壤表面噴水至濕潤，將高羊茅種子每盆8.0 g 均勻撒播在培養槽內，之后均勻覆蓋一層備用土。

實驗設置4 類處理：（1）添加微生物的電動處理組（EK+BIO）；（2）種植高羊茅的電動處理組（EK+P）；（3）添加微生物并種植高羊茅的處理組（P+BIO）；（4）種植高羊茅并添加微生物的電動處理組（EK+P+BIO）。每個處理3 個平行，實驗條件如表2 所示。實驗裝置如圖1 所示，包括土壤室即植物培養槽（280 mm×190 mm×150 mm），4 根圓柱形石墨電極（160 mm×10 mm），1個實時電流監測儀，1個直流電源和控制系統，供電電壓為25 V，通電時間為早上5：00至晚上9：00。其中4 根電極分別置于長方形的4 個頂點位置。

1.2 植物培育及樣品采集

各處理每隔3 d 澆一次水，每次約200 mL。定時測量各處理中植物的生長高度，記錄并取平均值；修復進行60 d 后結束實驗，收集植物鮮樣和土壤樣品。收集植物的地上部分測量濕質量，再用去離子水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，105 ℃下殺青2 h，然后在60 ℃下烘干至恒質量，測定干物質質量。

植物的含水率=（濕質量－干質量）/濕質量×100%

1.3 測定方法

1.3.1 pH值和電導率

稱取5.00 g土樣于離心管中，按土水比例1∶5，加入25 mL 去二氧化碳水振蕩1 h，靜置30 min。pH 計經過pH 4.00（25 ℃）標準緩沖溶液及pH 6.86（25 ℃）標準緩沖溶液標定后，將探頭浸入懸濁液直接測量樣品pH值，待pH值穩定后，記錄數據即可。

表1 供試土壤理化性質Table 1 The physicochemical properties of soil sample

表2 實驗設計Table 2 Design of experiments

圖1 實驗裝置示意圖Figure 1 Schematic diagram of experimental setup

同上，靜置30 min 后，于4 500 r·min-1條件下離心5 min，隨后將土壤電導率儀探針浸入上清液，直接測量讀數并記錄。

1.3.2 可培養細菌數量

采用稀釋平板法測定土壤中可培養菌數量[15]。取1.00 g新鮮土樣，加入裝有9 mL無機鹽培養液的試管中，振蕩30 min，取上清液1 mL，用無菌水進行梯度稀釋后，取200μL稀釋后菌液涂平板，30 ℃條件下恒溫培養24 h后計數。

1.3.3 土壤脫氫酶活性

土壤脫氫酶活性分析采用氯化三苯基四氮唑（TTC）還原法[16]，取4.00 g 土壤鮮樣于50 mL 離心管中，分別加入0.5 mL 的0.1 mol·L-1葡萄糖溶液，2 mL濃度為1%的Tris-HCl 緩沖液，1.5 mL 濃度為0.36%的Na2SO3溶液和2 mL 蒸餾水，將離心管置于振蕩器上180 r·min-1振蕩培養5 min，在37 ℃條件下恒溫振蕩避光培養24 h。然后加入0.5 mL甲醛終止反應，最后加5 mL 丙酮振蕩10 min，再經過12 000 r·min-1離心5 min，收集上清液于485 nm 波長下測定吸光值，根據標準曲線計算生成三苯基甲臜（TF）含量。

1.3.4 總石油烴含量

將土樣風干后過60 目篩，稱取4.00 g 于50 mL 離心管中，加入15 mL 三氯甲烷，加蓋，輕輕振搖1 min，超聲萃取30 min，4 500 r·min-1離心2 min。在漏斗中塞入脫脂棉，上面放置5～6 勺已烘干的無水硫酸鈉（400 ℃，2～3 h），將上清液進行過濾脫水。沉淀物再用15 mL 三氯甲烷以同樣的方法浸提兩次，合并浸提液。將浸提液通風濃縮至干，采用質量法測定總石油烴含量[17]。

總石油烴的降解率按照以下公式計算：

降解率=（C0－Ct）/C0×100%

式中：C0為污染物初始含量；Ct為降解后的污染物含量。

1.3.5 石油族組分分析

飽和烴、芳香烴、膠質、瀝青質分析參照巖石可溶性有機物和原油族組分柱層析分析方法[18]。

1.4 數據處理

數據處理采用Microsoft Excel 2010 軟件，采用Origin 8.5 軟件進行繪圖，采用SPSS 11.5 統計分析軟件對數據進行差異顯著性檢驗。

2 結果與討論

2.1 電流變化

圖2 修復過程中電流變化Figure 2 Changes of current during electrokinetic remediation

電動-微生物修復石油污染土壤時，裝置內種植高羊茅對電流變化的影響如圖2 所示。開放式電動修復系統，電流數值升降和系統水分補給密切相關，設置3 d為一個周期，每個補水周期開始時，電流均急劇升高，隨著系統內各種物理、化學及生物作用（電解、蒸發、生物消耗等）的進行，土壤含水量降低，電滲流減弱，電流逐漸降低，到下一個補水周期開始，電流又恢復到較高水平。圖中EK+P+BIO 和EK+BIO組電流變化總體趨勢相似，電流呈現從高到低遞減規律，50 d 之后逐漸趨于平緩，實驗末期即使繼續補水，電流也不再大幅度增加。在整個修復過程中，EK+P+BIO 處理組電流始終比EK+BIO 處理組高，修復末期EK+P+BIO 處理組電流趨于平緩后的值約為25 mA，而EK+BIO 處理組約為20 mA。這可能是由于高羊茅植株根系對土壤離子的附著作用，減緩了離子向陰陽兩極遷移，維持了系統電流穩定[5]，這一現象與土壤中電導率測定結果相一致。高羊茅對電流衰減趨勢的延緩作用，維持了系統的電動力效應，使電動作用對微生物代謝活性形成持續刺激。因此，種植高羊茅強化了電動-微生物對污染土壤的修復過程。

2.2 土壤pH值與電導率

不同處理的pH 值和電導率（EC）變化如表3 所示。土壤pH 值是電動處理過程中的一個重要參數，pH 值變化源于電極區的水解反應。表中所有處理組pH 值均在6.99～7.44 范圍內，變化范圍未超過一個單位幅度，處理間無顯著差異，可見周期性電極切換阻止了土壤室兩端極端pH 值產生，這與Reddy 等[19]的研究結果一致。施加電場的處理組觀察到輕微的土壤酸化，主要是由于電動過程陽極反應產生的H+（2H2O→O2+4H++4e-）與陰極產生的OH-（2e-+2H2O→2OH-+H2）相比具有更快的遷移速率[20]。

土壤中種植高羊茅延緩了電動修復系統的電流衰減趨勢，這也反應在土壤EC 值的變化上。土壤EC值與土壤中帶電粒子密切相關[21-22]。實驗60 d 后，施加電場處理的土壤EC 值與初始時相比顯著降低（P＜0.05）。這是由于電動過程導致了土壤中可移動離子向兩極聚集，以致非電極區土壤中可移動離子減少。各處理組初始時EC 值無顯著差異，60 d 后，EK+BIO處理組土壤EC 值顯著低于種植高羊茅的各處理組（P＜0.05），說明土壤中是否種植植物對修復后土壤的EC 值影響較大，種植植物在一定程度上可以維持土壤EC 值水平，這歸因于植物根系對土壤中可移動離子的物理化學作用。土壤EC值降低影響土壤內傳質過程，從而導致電動修復效率降低[23]。

2.3 植物生長及生理特征

株高是表現植物生長狀況差異最直觀的參數之一。不同處理條件下株高隨時間變化情況如圖3 所示，在0～15 d時間段內高羊茅生長速度較快，15 d后變慢，45 d后植物株高基本保持穩定。施加電場的EK+P+BIO處理組和EK+P處理組的株高均高于未施加電場的P+BIO處理組。這說明電場對植物的生長發育有明顯促進作用，這與已有的研究結果一致[8]。EK+P+BIO處理組株高整體高于EK+P處理組，說明植物與微生物的協同效應對植株生長具有一定的促進作用。Leyval 等[24]研究認為根際菌不僅能增加寄主植物對營養和水分的吸收，提高其抗逆性，而且還能提高土壤肥力。

圖3 不同處理條件下高羊茅株高變化Figure 3 Variation of plant height of tall fescue under different treatment conditions

表3 不同處理時間土壤pH值和EC值Table 3 Soil pH and EC values at different time

修復60 d 后各處理高羊茅植株生物量及含水率如圖4 所示。施加電場的EK+P+BIO 和EK+P 處理組干質量基本相當，均高于P+BIO處理組。各處理組含水率無明顯差異。整體來看，施加電場對修復植物的生物量有一定促進作用。Cang 等[21]研究證實了低電壓促進印度芥菜的生長和發育，繼續增大電壓后植株生物量產量下降。Bi 等[25]評估了AC/DC 電場對生物量產生的影響，研究得出AC 電場促進油菜生物量增加，電場作用增大了間質液的離子通量，刺激了植物的代謝活動，對生物質生產形成有益影響，從而提高植物修復效率。

2.4 根際微生物及土壤酶活性

2.4.1 可培養細菌數量變化

圖4 不同處理條件下高羊茅生物量和含水率變化Figure 4 Variation of biomass and moisture content of tall fescue under different treatment conditions

圖5 不同時間點土壤中可培養細菌數量變化Figure 5 Quantity change of culturable bacteria in soil at different time points

EK+BIO、EK+P+BIO 和P+BIO 處理土壤中可培養細菌數量隨時間和空間變化如圖5 所示。微生物初始投加量為1.0×108CFU·g-1，隨著修復時間延長，EK+BIO 和EK+P+BIO 處理中石油降解菌數量呈先增加后減少的趨勢。修復15 d 時，EK+BIO 和EK+P+BIO 處理中可培養細菌數量與初始投加量相比，分別增加了17.78%和22.23%。修復30 d 及60 d 時，EK+BIO 和EK+P+BIO 處理中可培養細菌數量顯著減少。主要是在電動初期（15 d內），土壤環境未發生明顯改變，且微生物繁殖所需的營養物質充足，電動作用加快了營養物質傳輸，增強了土壤內傳質過程，同時電解作用使氧含量增加，刺激了微生物生長代謝，使微生物數量增加[26]。15～30 d 以及30～60 d 內微生物數量呈現減少趨勢，表明后期外源菌數量不可避免地降低，同時電場作用導致土壤環境變化以及系統內有機質含量減少，這都會影響微生物的生長繁殖及活性。30 d后，EK+BIO處理組與EK+P+BIO處理微生物數量差距加大，歸因于15～30 d 期間成熟期高羊茅根系對土壤微生物起到維持作用，這與多數植物-微生物修復石油污染土壤的結論一致。可見，植物的根區環境為微生物提供營養物質、創造好氧環境，可促進根際微生物的代謝和繁殖。

未施加電場的P+BIO處理組，土壤中可培養細菌數量一直處于遞減狀態，其中0～15 d 減少了25.56%，15～30 d 減少了19.78%，數量減少率降低5.78%，間接說明成熟高羊茅植株的根系環境對土壤中可培養細菌數量有一定的維持作用。處理15 d時，未施加電場的P+BIO 處理組土壤中可培養細菌數量為7.44×107CFU·g-1，施加電場的EK+P+BIO 處理土壤中可培養細菌數量為1.22×108CFU·g-1，是前者的1.64倍。30 d時，雖然各處理微生物數量有所下降，但EK+P+BIO處理組土壤中可培養菌數量仍是P+BIO 處理組的1.67倍，施加電場后微生物數量與未施加電場相比有明顯增長。因此，適當電場能夠有效刺激微生物生長和繁殖，這與黃殿男[27]的研究結果一致，即使有植物存在情況下，微生物變化趨勢也明顯受到電場作用影響。

2.4.2 土壤脫氫酶活性

酶活性是表征微生物活性的一個重要指標，酶活性大小可反映出微生物利用土壤中污染物底物的生化反應強度[28]。本研究選擇脫氫酶作為評價土壤微生物活性的指標。實驗過程中EK+BIO、EK+P+BIO 和P+BIO處理的土壤脫氫酶活性變化如圖6所示。從整個修復周期看，EK+BIO和EK+P+BIO處理中脫氫酶活性均高于P+BIO處理組，這一結果與微生物數量隨時間變化特征一致。電動作用中氧化還原條件、營養物質傳輸等變化是導致微生物活性增加的原因[29-30]。

圖6 不同處理組土壤中脫氫酶活性變化Figure 6 Changes of dehydrogenase and catalase activities in soil treated with different treatments

修復15 d 時，EK+P+BIO 處理組土壤脫氫酶活性較初始值提高了23.36%，修復30 d 時，土壤酶活性有所降低，但仍高于初始酶活性，可能是由于試驗初期土壤中營養物質較豐富，土壤環境有利于微生物生長，使得前期土壤脫氫酶活性較高。隨著營養物質的消耗，細菌數量和脫氫酶活性降低。通過對比EK+BIO和EK+P+BIO處理組發現，修復15 d時，兩者脫氫酶活性相差不大，修復30 d 及60 d 時兩者差距增大，說明成熟期高羊茅植株對土壤微生物活性有一定的促進作用。另外，由于種植植物延緩了電流的下降趨勢，后期土壤修復系統中存在的低密度電流在一定程度上也刺激了微生物活性。

2.5 不同處理條件下土壤修復效果

各處理在不同時間點土壤中總石油烴含量如圖7 所示，修復15 d 時，添加微生物處理組EK+P+BIO、EK+BIO和P+BIO的石油烴降解率高于未添加微生物的EK+P 處理組，因為在此階段微生物活性較高，降解作用明顯。同時，EK+P+BIO 和EK+BIO 處理的修復效果在15 d時優于P+BIO組，這是由于電場作用提高了微生物活性，這與15 d時脫氫酶活性的實驗結果一致。修復15～30 d 內，種植植物的處理組EK+P+BIO、EK+P 和P+BIO 總石油烴的去除量明顯高于其在0～15 d 內的去除量。30～60 d 內EK+P+BIO、EK+P和EK+BIO 對總石油烴的去除量有所下降，可能是由30～60 d 內微生物數量減少，以及電動作用使營養鹽在兩極富集，微生物可利用養分減少所導致。

圖7 不同時間點土壤中總石油烴濃度Figure 7 Concentration of total petroleum hydrocarbons in soil at different time points

經過60 d 修復，EK+P+BIO 處理組的總石油烴降解效果最好，降解率達到48.21%；EK+BIO 處理組石油降解情況比較平穩，達到34.73%；P+BIO 處理組降解率為41.37%，修復效果優于EK+BIO 處理組；EK+P處理組降解率最低，為26.44%，EK+P+BIO 處理組的降解率是其1.82倍。Fan等[31]研究表明耦合電動和微生物修復技術通過電場來提高微生物修復效率，實現了微生物與電場的協同修復效應，與單獨使用生物和電場相比可增強微生物活性。Anderson 等[32]認為植物以多種方式幫助微生物轉化，根際在生物降解中起著非常重要的作用。根際可以加速脂肪烴類、多環芳烴類的降解。植物根系微生物密度會增大，多環芳烴的降解也增加。植物為微生物提供生存場所并可轉移氧氣，使根區的好氧轉化作用能夠正常進行，這也是植物促進根區微生物礦化作用的機制之一。另外，植物對電流的維持作用在一定程度上也刺激了系統內微生物活性，從而提高了總石油烴去除率。

對EK+P+BIO 處理組修復前后的石油族組分含量進行分析，由圖8可看出，EK+P+BIO 組實驗前后石油組分發生了明顯變化，其中烷烴和芳烴都有較高的去除率，與初始含量相比，飽和烴和芳香烴去除率分別為47.96%和75.14%。膠質和瀝青質變化不大，去除率分別為17.45%和15.77%。其中，烷烴的去除量高達7.12 g·kg-1，芳烴去除量為5.67 g·kg-1，這是由于烷烴在降解過程中所需能量較低，生物毒性較小[33]；此外，在電場作用下，烷烴β-氧化過程得以加速[34]。已有研究表明，在石油烴降解中，微生物傾向于優先選擇烷烴成分降解[35-36]。相應地，膠質和瀝青質物質由于較高的穩定性和疏水性，使其在土壤環境中去除率一般較低[18]，即使是外加電場等強化措施存在，提高這種重組分物質的去除率也相對較難。

圖8 EK+P+BIO組修復前后石油族組分含量變化Figure 8 Changes of petroleum group component content by EK+P+BIO treatment

3 結論

（1）電動-微生物修復裝置內種植高羊茅可有效延緩電流的衰減趨勢；成熟期高羊茅植株對系統內微生物的數量及活性有一定的維持作用。電動作用可以有效地刺激微生物的生長和繁殖，并提高微生物的代謝活性。

（2）EK+P+BIO 處理組總石油烴降解率高達48.21%，顯著高于其他處理。其中飽和烴和芳香烴的去除率分別達到47.96%和75.14%，而膠質和瀝青質的去除率相對較低。修復初期微生物數量豐富，活性較高，降解作用明顯；修復中期植物對修復效果的貢獻加大，可能原因是植物根際改善了土壤環境，為微生物降解提供了有利條件。