獸藥制劑中氯霉素的ELISA檢測方法的研究

張連彥,王亞芳,李應超,李蓉蓉,邢維維,楊 柳,陶曉奇

(1.北京市獸藥監察所,北京大興102629 ； 2.北京維德維康生物技術有限公司,北京海淀100095 ；3.西南大學食品科學學院,重慶北碚400715)

獸藥具有預防、治療和診斷動物疾病或者有目的地調節動物生理機能的作用，是養殖業中不可或缺的重要投入品。由于獸藥產業市場競爭激烈，某些不法企業為降低成本或提高療效，在獸藥制劑中非法添加禁用藥物，影響了獸藥質量，擾亂了獸藥市場秩序[1-2]。2009年新疆維吾爾自治區畜牧廳公布河北國威動物藥業有限公司、河南和協動物藥業有限公司、成都乾坤動物藥業有限公司在生產的獸藥中非法添加氯霉素[3]。

由于獸藥制劑成分復雜，提取和分離困難，基質干擾嚴重，常規的化學藥物分析方法并不適用，目前主要依靠高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用法和氣相色譜法等實驗室方法進行檢測[4-8]。這些方法雖然具有靈敏、精確的優點，但是普遍檢測成本昂貴、操作繁瑣、人員素質要求高、耗費時間長，不利于常規檢測[9]。酶聯免疫吸附法(ELISA)是使用酶進行標記的免疫分析方法，因其具有操作方便、儀器簡單的優點，在獸藥殘留分析中得到廣泛應用[10]。目前獸藥制劑中非法添加物的檢測幾乎均使用儀器設備，未見商品化ELISA試劑盒和針對獸藥制劑檢測的ELISA方法。本試驗以獸藥中最常見的非法添加氯霉素為目標物，通過抗原抗體篩選、反應條件優化、靈敏度、交叉反應率等指標的考察，建立運用于獸藥制劑中氯霉素的ELSIA檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑、用品 氯霉素酶標抗原、多克隆抗體，均由北京維德維康生物技術有限公司制備并保存；96孔固相酶標板，購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；其余試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器 GL-20G-Ⅱ型離心機，購自上海安亭科學儀器廠；MK3型酶標儀，購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 ELISA方法的優化 通過試驗確定試劑盒包被抗體濃度、酶標抗原濃度、包被條件、封閉液、封閉條件、競爭反應條件、緩沖液離子強度等參數，根據ODmax值和IC50(半數抑制濃度)值確定并建立直接競爭ELISA方法。

1.2.2 直接競爭酶聯免疫檢測步驟 包被：用碳酸鹽緩沖液(CB)將包被抗體稀釋到合適濃度，加入96孔固相酶標板中，100 μL/孔，4 ℃包被過夜，倒出孔中溶液，洗板3次，拍干；封閉：每孔加入150 μL封閉液，37 ℃孵育60 min，倒出孔中溶液，洗板3次，拍干；競爭反應：每孔加入50 μL標準品(或者是經過前處理的待測溶液)，再加入50 μL酶標記物工作液，室溫下反應30 min，倒出孔中溶液，洗板4次，拍干；加入底物液：每孔加入混合好的底物A、B液100 μL，室溫下避光顯色15-20 min；終止反應：每孔加入50 μL終止液，輕輕振蕩酶標板10 s，5 min后用酶標儀在450 nm下讀取酶標板吸光度值。

1.2.3 標準曲線繪制 標準品濃度分別為0.00、0.04、0.12、0.36、1.08、3.24 μg/mL和9.72 μg/mL。以標準品濃度的對數值為橫坐標、吸光率B/B0為縱坐標(B為各個標準品濃度的OD值，B0為0 μg/mL的OD值)，繪制標準曲線。

1.2.4 樣本前處理方法 本試驗采用直接提取法提取獸藥制劑中的氯霉素。稱取(0.5±0.05) g/mL樣品于50 mL離心管中，加入5 mL樣品稀釋液，渦動3 min；固體樣本需要4 000g以上，離心5 min或靜置10 min，液體樣本無需離心或靜置，取10 μL樣液加入到990 μL樣品稀釋液中，渦動30 s，取50 μL進行檢測。

1.2.5 檢出限 分別取20份空白樣品(針劑、粉劑、片劑、丸劑、顆粒劑)，按照1.2.4進行前處理，根據標準曲線求出測定值，計算出其平均值，再加上3倍標準差，即為最低檢測限。

1.2.6 添加回收試驗 取空白樣品(針劑、粉劑、片劑、丸劑、顆粒劑)，按1.0 mg/kg和2.0 mg/kg氯霉素標準品進行添加，每個添加5個平行。用3個批次的試劑盒測定，計算添加回收率及批內和批間變異系數。

1.2.7 與儀器方法比較 按照1.2.2檢測步驟和1.2.4前處理方法和儀器法分別對50份獸藥制劑盲樣進行測定，比較測定結果。儀器方法采用農業部2448號公告《中獸藥散劑中非法添加氯霉素檢查方法》中的高效液相色譜-串聯質譜法，獸藥粉劑中氯霉素檢測方法中液相色譜-串聯質譜法[7]，復方中草藥中氯霉素檢測方法中的高效液相色譜法[8]進行操作，方法對獸藥制劑中氯霉素的檢測限分別為1.0、0.5 mg/kg和0.2 mg/kg，在添加濃度5～20 mg/kg范圍內，回收率為80.6%～96.3%。

2 結果

2.1 ELISA反應條件的優化 氯霉素直接競爭ELISA試劑盒各組分篩選及條件優化結果如下：包被抗體最佳包被濃度為0.2 μg/mL，酶標抗原最佳工作濃度為1∶40 000(酶標抗原濃度為1 mg/mL)；包被條件為4 ℃過夜包被；封閉液為5%脫脂奶粉，37 ℃封閉2 h；最佳競爭反應條件為室溫下反應30 min；最佳緩沖液離子強度為0.01 mol/L。

2.2 標準曲線的繪制與擬合 跟據優化反應的結果，按照1.2.2檢測步驟檢測不同濃度的氯霉素標準品并繪制標準曲線。標準曲線回歸方程為：y=-0.016 9+1.187 9/[1+(x/0.147 2)0.149 0]，相關系數(R2)為0.992 8，IC50為0.147 2 μg/mL。

圖1 氯酶素直接競爭ELISA標準曲線圖
Fig.1 Standard curve of direct competitiveELISA for chloramphenicol

2.3 檢出限 取空白樣品按照1.2.4進行前處理，按照1.2.2進行檢測，根據標準曲線求出測定值，計算最低檢測限。結果表明，本方法樣品檢測限分別為0.99、0.96、0.98、0.97、098、0.99 mg/kg和0.95 mg/kg，為防止假陽性的出現，將檢測限定為1.0 mg/kg。

2.4 添加回收試驗 使用3個批次的試劑盒檢測氯霉素添加樣品，計算添加回收率及批內和批間變異系數，結果見表1，各添加濃度的回收率為81.00%～112.00%，批內變異系數為2.67%～9.62%，批間變異系數為6.90%～9.71%。

表1 試劑盒準確度和精密度Table 1 Accuracy and precision of the kit

2.5 與儀器方法比較 按照1.2.2檢測步驟和儀器法分別對50份獸藥制劑盲樣進行測定，獸藥制劑種類見表2，以檢測限作為陰陽性判定值比較檢測結果，2種方法均未檢出氯霉素，結果一致。

表2 用于試劑盒和儀器方法比對的實測獸藥制劑種類Table 2 The veterinary preparations detected with this kit and instrument method

3 討論

氯霉素可抑制人的骨髓造血機能，引起血細胞減少、灰嬰綜合征和再生障礙性貧血[11]。養殖過程若使用含有較高濃度的氯霉素，將導致禽畜體內藥物殘留，之后通過食物鏈進入人體，成為威脅人類健康的隱患。目前氯霉素已經被許多國家列為動物養殖的禁用藥物[12]。我國農業部2002年發布的193號公告中明令禁止在飼料、動物飲用水和畜禽水產養殖過程中使用氯霉素[13]。本試驗建立的氯霉素直接競爭ELISA方法，優化后的反應條件為：包被抗體濃度為0.2 μg/mL，酶標抗原稀釋倍數為1∶40 000，包被條件為4 ℃包被過夜，封閉條件為5%脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，競爭反應條件為室溫下反應30 min，緩沖液離子強度為0.01 mol/L。根據優化條件建立的氯霉素直接競爭ELISA方法檢出限為1 mg/kg，添加回收率為81.00%～112.00%，批內和批間變異系數小于10%，與儀器方法比較，檢測結果一致性好。

液相色譜-串聯質譜法檢測獸藥粉劑中氯霉素的檢測限為0.5 mg/kg[7]，高效液相色譜法測定復方中草藥中氯霉素的檢測限為0.2 mg/kg，添加回收率為80.6%～96.3%[8]，本試驗中建立的氯霉素直接競爭ELISA檢測方法與儀器方法差距較小，可以用于獸藥制劑中非法添加氯霉素的初篩。該方法前處理方法簡單，檢測時間短，準確度高，可以用于檢測獸藥制劑中氯霉素的非法添加，為獸藥質量安全監管工作提供技術支撐，進一步提高獸藥質量安全水平，保障養殖業健康發展和動物產品質量安全。