促紅細胞生成素在視網膜新生血管形成中的作用

江海波，鄧婭青，熊思齊*

(1.中南大學湘雅醫院眼科中心，湖南 長沙 410008; 2.眼科學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410008)

視網膜新生血管作為糖尿病視網膜病變、視網膜靜脈阻塞、早產兒視網膜病變和視網膜血管炎等疾病的共同病理過程，受到眾多促血管生成因子的調節。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)的主要生物學功能是刺激幼紅細胞前體的分化和增殖，刺激網織紅細胞釋放進入血液循環，并刺激細胞內蛋白質合成而起到調節紅細胞生成的作用。同時，EPO作為血管內皮細胞的分裂原與血管內皮細胞生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)具有相當的促血管生成潛力。EFO被證實參與了女性生殖器官血管形成[1]、炎癥性血管形成[2]、傷口愈合過程中血管新生[3]及腫瘤新生血管形成[4]。因此，本研究擬以氧誘導的大鼠增殖性視網膜病變(OIR)為模型，揭示EPO的表達與視網膜新生血管形成的對應關系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

清潔級C57BL/6J小鼠(中國科學院上海實驗動物中心)；Trizol裂解液及微量總RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司);反轉錄及cDNA合成試劑盒(美國Fermentas Life Science公司)；山羊抗鼠EPO多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；羊抗鼠β-actin單克隆抗體(美國Sigma公司)；BCA Protein Assay Reagen Kit(美國Pierce公司)；ECL試劑盒(美國Pierce公司)

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠視網膜新生血管動物模型的建立 采用Smith等的方法建立氧誘導增殖性視網膜病變模型[5]。將鼠齡為出生后7天(P7)的C57BL/6J小鼠連同母鼠及測氧儀一起放入密閉的氧艙中，保持氧艙中的壓力為常壓(每天2～3次)，控制氧濃度為75%±2%，溫度23±2 ℃，每隔2天替換母鼠。室內采用日光燈照明，光照周期為12 h/12 h。5天(P12)后將小鼠放回到正常環境中繼續飼養。

1.2.2 OIR模型鼠的鑒定 過量麻醉處死出生后第17天的正常組小鼠(5只)及模型鼠(5只)，摘除眼球并4%多聚甲醛固定過夜。顯微鏡下沿角膜緣剪除角膜，去除晶狀體和虹膜組織后，取出視網膜組織，采用內皮細胞特異性標記物isolectin4(IB4)-Alexa594抗體4度孵育過夜，PBS洗滌后，視網膜鋪片，熒光顯微鏡下拍照觀察視網膜組織的血管結構。

1.2.3 RT-PCR測定EPO mRNA的表達 采用Trizol一步法提取出氧艙后(P12)0天、出氧艙后半天(P12.5)、1天(P13)、一天半(P13.5)、2天(P14)、5天(P17)、1周(P19)及2周(P26)等8個時間點模型小鼠的視網膜總蛋白(每個時間點4只小鼠)，提取總RNA并逆轉錄成cDNA，PCR儀擴增目的基因。EPO引物序列：上游-5′TGGAGGTGGAAGAACAGG3′；下游5′GCAGTGAAGTGAGGCTA CG 3′，PCR產物大小為165 bp。β-actin引物序列：5′CTGGGACGACATGGAGAAGA 3′；下游5′AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC 3′ PCR產物大小為564 bp。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進行30個循環，72 ℃再延伸10 min。所有標本檢測均重復3次。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100 V，通電時間為20～30 min。采用Eagle eyeⅡ圖像分析儀對電泳條帶進行灰度值分析。結果以EPO與內參照β-actin mRNA擴增產物的灰度相對比值表示。

1.2.4 Western blot測定EPO蛋白質的表達 提取P12、P12.5、P13、P13.5、P14、P17、P19及P26模型鼠視網膜組織(每個時間點4只小鼠)，視網膜組織研磨后加入蛋白抽提液裂解，離心提取蛋白后測定蛋白質濃度。取蛋白樣品于SDS-PAGE凝膠中電泳，待目的蛋白接近凝膠底部時停止電泳，120V恒壓電轉移至PVDF濾膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗羊抗鼠EPO抗體和羊抗鼠β-actin抗體，4 ℃過夜。再加入二抗(生物素化的兔抗羊IgG)，室溫孵育2 h，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG室溫孵育30 min后，ECL化學發光法檢測，以β-actin作為內對照。

1.3 統計學分析

采用SPSS 11.0軟件包對數據進行統計分析。多組間比較采用ANOVA方差分析，兩組間的比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 熒光造影視網膜鋪片觀察視網膜血管形態

正常P17小鼠視網膜鋪片可見整個視網膜血管分布呈均勻的網狀結構，視盤中央發出的血管規則地呈放射狀向周邊部走行，視網膜血管間的毛細血管交織成網狀(圖1A)。模型組小鼠視盤周圍毛細血管閉塞，可見大片無灌注區。視網膜大血管不規則擴張，走行紆曲。中周部正常毛細血管網消失，血管密度增高且分布紊亂，可見新生血管叢和熒光滲漏(圖1B)。

圖1 OIR模型鼠視網膜鋪片A：正常鼠視網膜血管分布呈均勻的網狀結構；B：模型鼠視網膜中央區可見大片無灌注區(☆所示)，大血管迂曲擴張，視網膜中周邊部有大量新生血管(箭頭所示)

2.2 視網膜組織中EPO mRNA表達的動態變化

為了探討OIR模型鼠視網膜新生血管發生過程中，EPO mRNA表達變化的動態趨勢。我們選取出氧艙后0天(P12)、半天(P12.5)、1天(P13)、一天半(P13.5)、2天(P14)、5天(P17，此時視網膜新生血管形成數目最多)、1周(P19)及2周(P26，此時視網膜新生血管已完全消退)等8個時間點的視網膜組織，采用RT-PCR技術來檢測OIR模型鼠視網膜組織中EPO mRNA的表達水平。視網膜組織中EPO mRNA表達水平如圖2A所示：EPO mRNA擴增產物大小為165bp，β-actin擴增產物大小564bp。圖2B為圖3A相對應的電泳條帶中EPO與內參照β-actin mRNA擴增產物的灰度相對比值。結果表明:出氧艙后半天(P12.5)視網膜組織中EPO mRNA表達開始升高。隨著視網膜組織中缺血、缺氧的加重，出氧艙后2天(P14)視網膜組織中EPO mRNA表達到達高峰，與P12天模型鼠視網膜組織中EPO mRNA表達水平比較有統計學差異(P<0.05)。出氧艙后5天的模型鼠，此時視網膜新生血管形成數目最多，視網膜組織EPO mRNA表達仍維持在較高水平，但較P14天時EPO mRNA表達水平已有所下降。出氧艙后2周的模型鼠視網膜新生血管已完全消退，此時網膜組織EPO mRNA表達明顯下調，與P12天EPO mRNA表達水平比較無統計學差異(P>0.05)。

圖2 OIR模型鼠視網膜新生血管形成中EPO mRNA的表達A：RT-PCR法檢測不同時間點OIR模型鼠視網膜組織中EPO mRNA表達電泳圖；B：各泳道EPO與內參照β-actin mRNA擴增產物的灰度相對比值，與P12模型鼠視網膜組織中EPO mRNA表達水平比較，*P<0.05

2.3 OIR模型鼠視網膜組織中EPO蛋白質表達的動態變化

為探討OIR模型鼠視網膜新生血管形成中EPO蛋白質表達變化的動態趨勢，我們取P12、P12.5、P13、P13.5、P14、P17、P19及P26天的OIR模型鼠視網膜組織，運用Western blot技術來檢測模型鼠視網膜組織中EPO蛋白質的表達水平(如圖3)。圖3B為圖3A相對應的電泳條帶中EPO與內參照β-actin蛋白條帶的灰度相對比值。與視網膜組織中EPO mRNA表達變化趨勢相一致，隨著模型鼠視網膜組織中缺血、缺氧狀態的出現，視網膜組織中EPO蛋白表達于出氧艙后半天(P12.5)開始升高，于出氧艙后2天(P14)視網膜組織中EPO蛋白表達到達高峰，與P12天模型鼠視網膜組織中EPO蛋白表達水平比較有統計學差異(P<0.05)。然后緩慢開始下降，出氧艙后2周時視網膜組織中EPO蛋白表達水平已明顯下調，與P12天模型鼠視網膜組織中EPO蛋白表達水平比較無統計學差異(P>0.05)。

圖3 OIR模型鼠視網膜新生血管形成中EPO蛋白質的表達A:Western blot技術檢測不同時間點OIR模型鼠視網膜組織中EPO蛋白表達電泳圖；B:各泳道EPO與內參照β-actin蛋白條帶的灰度相對比值，與P12模型鼠視網膜組織中EPO蛋白質表達水平比較，*P<0.05

3 討 論

VEGF被認為是視網膜新生血管關鍵性的因子，抗VEGF藥物在臨床上展現出對于視網膜血管新生性疾病的良好療效[6]。近年來，有文獻報道，EPO在體外促進血管內皮細胞增生、遷移和成管作用與VEGF相當[7]。另外，EPO可以上調細胞基質金屬蛋白酶2(matrixm-etalloproteinases2，MMP2)表達，破壞毛細血管基底膜，協助血管內皮細胞遷移，促進新生血管的形成[8]。在體實驗顯示，EPO可誘導雞卵囊胚形成新生血管，其作用與VEGF相當[8]。這說明，EPO還參與體內生理及病理性新生血管血管形成過程。在創傷修復過程中，給予重組的EPO可通過增加創面微血管生成密度，改善創面血流灌注縮短愈合時間。EPO還參與腫瘤新生血管的形成。中樞神經系統腫瘤、乳腺癌、胃癌的腫瘤細胞和毛細血管內皮細胞都發現了EPOR的表達，且EPO的表達水平與腫瘤血管形成和病情進展密切相關，給予EPO拮抗劑可以通過減少腫瘤血管形成而抑制腫瘤生長[9]。由此可見，EPO是一種重要的促血管生成因子，在視網膜新生血管形成中起重要的調控作用。

視網膜新生血管關系最為密切的病理改變是缺血、缺氧[10-11]。缺氧的視網膜組織內HIF-1α蛋白降解受到抑制，HIF-1α蛋白在細胞內沉積與HIF-1β蛋白二聚化形成HIF-1復合物[12]。HIF-1復合物作為轉錄因子能與啟動子上游含有低氧反應元件(Hypoxia response element,HRE)的靶基因相結合，與協同轉錄激活因子CBP/p300共同促進下游靶基因的轉錄。HIF-1的靶基因中包括血管內皮細胞生長因子及受體、誘導性一氧化氮合酶、內皮素-1、表皮生長因子[13]、血小板源性生長因子-B[14]等促進血管生成的因子，它們在血管生成過程的不同環節發揮著作用。而促紅細胞生成素基因中含有低氧反應元件HRE[15]。本研究表明，氧誘導的增殖性視網膜病變模型小鼠出現視網膜新生血管形成，視網膜組織出現缺血缺氧狀態，并于缺氧后12小時EPO表達逐漸增高，缺氧后48小時到達高峰并維持在較高的水平。視網膜組織合成并分泌的EPO蛋白質能通過在視網膜內擴散最終與視網膜血管內皮細胞上的EPO受體結合，通過細胞內信號傳導途徑引起血管內皮細胞增生、遷移、視網膜毛細血管出芽，參與誘導視網膜新生血管的形成。同時我們還發現，隨著視網膜組織內新生血管的出現及缺血、缺氧狀態的改善，視網膜組織中EPO表達逐步下調，在視網膜新生血管消退期，視網膜組織中EPO的表達水平逐步恢復到基線水平。由此可見，EPO表達水平的改變與視網膜新生血管的形成具有時間上的對應關系。這種現象的最好解釋是缺血缺氧的視網膜組織通過HIF-1從轉錄水平上調EPO的表達，EPO通過促新生血管形成作用與VEGF等因子協同誘導視網膜新生血管的形成。

綜上所述，EPO參與了氧誘導的增殖性視網膜病變模型鼠視網膜新生血管的形成，針對EPO的治療可能為臨床視網膜新生血管性疾病開辟新的治療途徑。