J亞型禽白血病病毒水平傳播的試驗(yàn)

張桂枝,龍瑞艷,徐明國(guó),靳雙星

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河南鄭州450046 ； 2.河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心,河南鄭州450046 ； 3.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆石河子832003)

禽白血病(Avian leukosis,AL)是重要的種源性疾病和免疫抑制性疾病，全國(guó)獸醫(yī)衛(wèi)生事業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2016-2020年)將AL列為重點(diǎn)凈化的家禽疫病。按照國(guó)家中長(zhǎng)期動(dòng)物疫病防治規(guī)劃(2012-2020年)要求，到2020年國(guó)內(nèi)全部種雞場(chǎng)AL達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。盡管?chē)?guó)內(nèi)許多種雞場(chǎng)開(kāi)展了AL的凈化工作，但目前該病在我國(guó)雞群中感染仍比較復(fù)雜，特別是地方品種雞經(jīng)常出現(xiàn)2種或2種以上亞型混合感染[1-9]，以及禽白血病病毒(ALV)和網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)混合感染[10-14]。張倩在2011-2016年間對(duì)我國(guó)19個(gè)省60個(gè)祖代場(chǎng)ALV的感染情況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALV- p27抗原場(chǎng)陽(yáng)性率為18.75%～66.67%，ALV-J抗體場(chǎng)陽(yáng)性率為26.3%～64.71%，ALV-AB抗體場(chǎng)陽(yáng)性率為36.84%～88.24%[14]。馬美哥等從2018年以來(lái)進(jìn)口的某品種肉種雞體內(nèi)分離出了J亞群禽白血病病毒[15]。垂直傳播為ALV的主要傳播方式，其決定了感染的延續(xù)性和持續(xù)性；水平傳播保證了ALV得以維持。為了探討陰性雞與先天感染ALV-J的陽(yáng)性雞接觸一定時(shí)間后，ALV-J的水平傳播情況，特開(kāi)展本試驗(yàn)，旨在為種雞場(chǎng)制定禽白血病凈化方案和更好地開(kāi)展本病凈化提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 陽(yáng)性雞來(lái)源于河南省某地方品種雞場(chǎng)；陰性雞由SPF種蛋(購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物科技有限公司)在河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院家禽生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室孵化機(jī)內(nèi)孵化而成。

1.1.2 主要試劑 超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒、2×EsTaqMaster Mix，均購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司； ALV-J 抗體檢測(cè)試劑盒、ALV- p27抗原檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司； 抗ALV- J單克隆抗體JE9由揚(yáng)州大學(xué)秦愛(ài)建教授惠贈(zèng)；FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG熒光抗體(bs-0310G-FITC)，購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)液、新生牛血清，均購(gòu)自GIBCO公司。

1.1.3 細(xì)胞 DF-1細(xì)胞由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.4 主要儀器 ELISA酶標(biāo)儀、二氧化碳培養(yǎng)箱，均購(gòu)自Thermo公司；PCR儀，購(gòu)自美國(guó)ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自DNR公司；核酸凝膠電泳儀，購(gòu)自Bio-RAD公司；倒置熒光顯微鏡，購(gòu)自日本尼康公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇 陽(yáng)性雞的選擇：0日齡采集胎糞，利用ELISA方法檢測(cè)其ALV-p27，并于7日齡采集血漿接種DF-1細(xì)胞，取細(xì)胞培養(yǎng)液利用RT-PCR檢測(cè)ALV-J抗原，二者均為陽(yáng)性的20只雞作為陽(yáng)性雞。陽(yáng)性雞和60只陰性雞在同一籠內(nèi)飼養(yǎng)，按照種雞的飼養(yǎng)管理標(biāo)準(zhǔn)正常飼養(yǎng)和接種免疫。

1.2.2 胎糞和泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原檢測(cè) 按照IDEXX ALV- p27抗原檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 血清ALV-J抗體檢測(cè) 采集試驗(yàn)雞促凝血，離心分離血清，然后按照IDEXX ALV-J抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)相應(yīng)抗體。

1.2.4 外源性ALV的分離 將DF-1細(xì)胞傳至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞長(zhǎng)成 60%～70%單層時(shí)，取200 μL試驗(yàn)雞血漿接種于DF-1細(xì)胞，37 ℃ 繼續(xù)孵育2 h，棄上清液，更換為含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃ 5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)9 d后，用ALV-p27抗原ELISA檢測(cè)試劑盒逐孔檢測(cè)p27抗原，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)ALV-p27。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)與合成 針對(duì)ALV相對(duì)保守的p27基因序列和ALV-J的特異性gp85基因序列設(shè)計(jì)合成鑒定引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物名稱(chēng)、序列以及目的片段大小見(jiàn)表1。

表1 ALV-p27、ALV-J 鑒定引物Table 1 The identification primer of ALV-p27、ALV-J

1.2.6 RT-PCR檢測(cè)ALV-p27及ALV-J亞群鑒定 收集接種試驗(yàn)雞血漿培養(yǎng)9 d后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，高速離心除去細(xì)胞碎片后，使用超純RNA提取試劑盒提取總RNA，以此為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得病毒基因組cDNA。并以此cDNA為模板，分別用 ALV- p27的鑒定引物和ALV-J 特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。ALV- p27 的反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。ALV-J反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，64 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。用 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.2.7 ALV-J的間接免疫熒光鑒定(IFA) 接種試驗(yàn)雞血漿的DF-1細(xì)胞培養(yǎng)9 d后用PBS 洗細(xì)胞3 次，每次5 min；然后用4%多聚甲醛常溫固定20 min； 棄去固定液，自然干燥，再用PBS 漂洗3 次，每次5 min；加入抗ALV- J單克隆抗體JE9，37 ℃孵育1 h后用PBS漂洗3次，每次5 min；再加入FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG熒光抗體，37 ℃ 孵育1 h，用PBS漂洗3次，使用倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 泄殖腔ALV-p27檢測(cè)結(jié)果 陰性雞與陽(yáng)性雞直接接觸7、15、25、35、45、55、65、75 d和90 d后，泄殖腔ALV-p27陽(yáng)性率變化動(dòng)態(tài)曲線見(jiàn)圖1。由圖1可知，陰性雞與陽(yáng)性雞接觸15 d，有3.33%雞只泄殖腔中可檢測(cè)到ALV-p27抗原。從15～45 d泄殖腔ALV-p27陽(yáng)性率逐漸增高，55 d略有降低，65 d陽(yáng)性率達(dá)高峰為50.00%，65～90 d泄殖腔ALV-p27抗原陽(yáng)性率逐漸降低。

圖1 陰性雞與陽(yáng)性雞接觸一定時(shí)間后泄殖腔帶毒排毒動(dòng)態(tài)
Fig.1 After mixing antigen-negative and antigen-positivechickens for a period of time,the intoxication anddetoxification in cloaca of antigen-negative

2.2 血漿病毒分離結(jié)果 陰性雞與陽(yáng)性雞直接接觸65 d，血漿中外源性ALV分離陽(yáng)性率見(jiàn)表2。由表2可知，采用ELISA、RT-PCR兩種方法檢測(cè)DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液中外源性ALV，陽(yáng)性率分別為60.00%、56.67%。其中RT-PCR檢測(cè)為陰性的1個(gè)樣品，ELISA檢測(cè)為陽(yáng)性；其他樣品2種檢測(cè)方法結(jié)果完全吻合。說(shuō)明ELISA和RT-PCR檢測(cè)的匹配度很高；陰性雞與陽(yáng)性雞早期密切接觸，外源性ALV的感染幾率相當(dāng)高。圖2為RT-PCR檢測(cè)ALV-p27在720 bp處擴(kuò)增到的特異性條帶。

表2 外源性ALV分離陽(yáng)性率Table 2 The positive rates of exogenous ALV

圖2 ALV-p27 RT-RCR檢測(cè)電泳圖
Fig.2 ALV-p27 results by RT-RCRM:Marker;1～7:部分樣品 M:Marker; 1～7:Some samples

2.3 ALV-J亞型鑒定結(jié)果 陰性雞與陽(yáng)性雞直接接觸65 d，采用RT-PCR和IFA檢測(cè)到ALV-J抗原陽(yáng)性率分別為56.67%和63.33%，結(jié)果見(jiàn)表3。圖3為RT-PCR檢測(cè)ALV-J在924 bp處擴(kuò)增到的特異性條帶；圖4和圖5分別為采用IFA檢測(cè)ALV- J陰性樣品和陽(yáng)性樣品結(jié)果。

表3 ALV-J亞型鑒定結(jié)果Table 3 The results of ALV-J Subtype identification

圖3 ALV-J RT-RCR檢測(cè)電泳圖
Fig.3 Detection electrophoretic diagram ofALV-J by RT-RCRM:Marker; 1～7: 部分樣品 M:Marker; 1～7: Some samples

圖4 ALV-J IFA檢測(cè)陰性樣品熒光顯微鏡(10×10)觀察結(jié)果
Fig.4 ALV-J results of negative samples by IFAfluorescence microscopy(10×10)

圖5 ALV-J IFA檢測(cè)陽(yáng)性樣品熒光顯微鏡觀察結(jié)果(10×10)
Fig.5 ALV-J results of negative samples by IFAfluorescence microscopy(10×10)

2.4 血清中ALV-J抗體檢測(cè)結(jié)果 陰性雞與陽(yáng)性雞直接接觸7、15、25、35、45、55、65、75 d和90 d，血清抗體陽(yáng)性率變化動(dòng)態(tài)見(jiàn)圖6。由圖6可知，陰性雞與陽(yáng)性雞直接接觸7～35 d，陰性雞血清中一直未檢測(cè)到ALV-J抗體；45 d ALV-J抗體陽(yáng)性率為20%，隨后ALV-J抗體陽(yáng)性率逐漸上升，65 d達(dá)最高峰為63.33%，65～90 d逐漸降低。

圖6 陰性雞與陽(yáng)性雞接觸一定時(shí)間后抗體產(chǎn)生動(dòng)態(tài)
Fig.6 The serum antibodies of antigen-negativehicken after mixing antigen-negative andantigen-positive chickens for a period of time

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，陰性雞與感染ALV-J陽(yáng)性雞接觸15 d，泄殖腔中可檢測(cè)到ALV-p27抗原，從15～45 d泄殖腔ALV-p27陽(yáng)性率逐漸增多，65 d陽(yáng)性率達(dá)高峰為50.00%，45～90 d泄殖腔均維持較高的抗原陽(yáng)性率；65日齡采集陰性雞血液接種DF-1細(xì)胞，利用ELISA、RT-PCR檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)液中外源性ALV陽(yáng)性率分別為60.00%和56.67%；利用RT-PCR和IFA方法檢測(cè)到細(xì)胞培養(yǎng)液中ALV-J抗原陽(yáng)性率分別為56.67%和63.33%。陰性雞與感染ALV-J陽(yáng)性雞直接接觸45 d ALV-J抗體陽(yáng)性率為20%；隨后ALV-J抗體陽(yáng)性率逐漸上升，65 d達(dá)高峰為63.33%。說(shuō)明陰性雞與先天感染ALV-J的陽(yáng)性雞直接接觸混合飼養(yǎng)，通過(guò)水平傳播被感染外源性ALV的幾率相當(dāng)高，這與許多資料報(bào)道的外源性ALV可以通過(guò)直接或間接接觸從一只雞傳染給其他雞[16-17]相一致。本試驗(yàn)表明，陰性雞與陽(yáng)性雞直接接觸水平傳播被感染ALV-J雞只泄殖腔排毒、血液帶毒和抗體產(chǎn)生，65日齡均處于高峰。因此，在開(kāi)展禽白血病凈化時(shí)，65日齡左右是檢測(cè)的一個(gè)關(guān)鍵時(shí)期。

出雛時(shí)，雛雞之間的緊密接觸是ALV橫向傳播的一種有效傳播途徑，經(jīng)垂直傳染帶有ALV的雛雞體內(nèi)病毒粒子具有很高的感染性，可通過(guò)胎糞向外排毒，同時(shí)雛雞又有相互啄肛的習(xí)慣，導(dǎo)致很高比例的出殼雛雞被橫向傳播。老齡雞的唾液和糞便中也存在感染性病毒粒子，都是ALV水平傳播的傳染源。

本試驗(yàn)采用ELISA、RT-PCR兩種方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALV-p27，采用RT-PCR和IFA兩種方法檢測(cè)ALV-J抗原，檢測(cè)結(jié)果符合率相當(dāng)高。但RT-PCR方法檢測(cè)到的2個(gè)陰性樣本IFA方法檢測(cè)為陽(yáng)性，這與陳俊霞研究報(bào)道IFA檢測(cè)的靈敏度更高，可檢測(cè)出一些低滴度的樣品，尤其當(dāng)病毒含量較低時(shí)該方法優(yōu)勢(shì)更明顯相符合[16]。