豬繁殖與呼吸綜合征病毒誘導的缺失第3外顯子的腫瘤壞死因子受體介導細胞凋亡能力的探究

許嘉宇,李 忍,田志軍,陳洪巖,王玉娥

(中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 獸醫生物技術國家重點實驗室 黑龍江省實驗動物與比較醫學重點實驗室,黑龍江哈爾濱150069)

細胞凋亡包括內源性凋亡和外源性凋亡2種方式，內源性凋亡是細胞器釋放的凋亡蛋白促發的，外源性凋亡主要由腫瘤壞死因子(Tumor necrosis facter,TNF)超家族相關分子與腫瘤壞死因子受體(Tumer necrosis factor receptor,TNFR)相結合誘導產生的[1]。凋亡在許多病毒感染過程中發揮重要的作用，病毒感染的細胞可通過啟動凋亡而抑制病毒的感染。有研究表明，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)在感染的早期可通過下調p53的表達發揮抗凋亡的作用，進而有助于病毒的感染[2]。而在感染的晚期，PRRSV可通過抑制PI3K依賴的AKT通路促進細胞凋亡[3]。本實驗室前期研究發現，PRRSV感染可刺激豬肺泡巨噬細胞(PAM)分泌TNF-α，分泌型的TNF-α可抑制PRRSV的感染[4]。TNF-α是通過與TNFR結合后募集細胞內的凋亡相關蛋白，激活凋亡信號通路發揮功能[5]。因此TNFR1可能參與PRRSV引起的凋亡，但目前尚無TNFR1在PRRSV感染過程中的功能的報道。本研究發現，在PRRSV感染的PAM細胞中TNFR1以2種分子量不同的形式TNFR1和TNFR1-d3存在，其中，TNFR1-d3有129 bp堿基的缺失突變。與野生型TNFR1相比，突變型TNFR1-d3不具有促進TNF-α介導的細胞凋亡功能，說明該129 bp堿基參與調控細胞凋亡。本研究揭示了PRRSV感染和細胞凋亡的新機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 豬肺泡巨噬細胞(PAM)、人胚腎細胞(HEK293)、PRRSV HuN4株，均由本實驗室保存； 大腸桿菌DH5α感受態由本實驗室制備；pcDNA3.1(+)真核表達載體，購自Invitrogen公司；RIPA裂解液、MLV反轉錄酶，均購自海基生物科技有限公司；DEPC水，購自BIOSHARP公司；RNA提取試劑盒RNeasy Plus Mini Kit，購自QIAGEN公司；放線菌酮、Flag單克隆抗體和β-actin單克隆抗體，均購自Sigma-Aldrich公司；豬源重組蛋白TNF-α，購自R&D公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)，購自碧云天生物技術有限公司。

1.2 引物設計 根據GenBank中已登錄的豬源TNFR1的基因序列(NM.213969.1)，用Primer 5軟件設計引物，見表1，由吉林庫美生物科技有限公司合成。

表1 PCR擴增引物Table 1 Primers used in amplification

1.3TNFR1和TNFR1-d3真核載體的構建及鑒定 PRRSV HuN4株感染PAM細胞24 h后， 提取RNA，將其反轉錄獲得的cDNA為模板，利用表1的上下游引物(退火溫度：60 ℃)，按傳統方法進行PCR反應擴增目的片段。將擴增的目的基因(TNFR1和TNFR1-d3)片段純化后經KpnI /EcoR I雙酶切，并分別克隆至真核表達載體pcDNA3.1 (+)中獲得重組質粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3，送至吉林庫美生物科技有限公司測序鑒定。

1.4TNFR1和TNFR1-d3真核載體表達及鑒定 將構建好的真核表達質粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3分別轉染至HEK293細胞中，轉染24 h后，裂解細胞收集蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳；將蛋白轉印到PVDF 膜上， 于5%脫脂乳中室溫封閉2 h；然后用 PBST 漂洗 3 次，每次 10 min； 4 ℃條件下，與相應一抗(anti-Flag: 1∶1 000，anti-β-actin: 1∶10 000)于水平搖床孵育過夜；PBST漂洗3次，每次漂洗10 min； 然后用相應標記的二抗室溫條件下避光反應45 min，PBST洗滌3次，每次洗滌10 min；用近紅外熒光掃描儀掃描PVDF膜保存并分析試驗結果。

1.5 TNFR1和TNFR1-d3對細胞凋亡的影響 將構建好的真核表達質粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3分別轉染至HEK293細胞中，轉染24 h后，加入TNF-α(10ng/mL)+放線菌酮(2 μg/mL) 處理細胞4 h誘導細胞凋亡，利用流式細胞術檢測TNFR1和TNFR1-d3對細胞凋亡的影響。棄掉處理細胞培養液，用PBS洗滌貼壁細胞1次，加入適量胰酶細胞消化液消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來，轉移到離心管內，1 000 g離心5 min，棄上清，收集細胞，PBS洗細胞1次。取約100萬個重懸的細胞，1 000 g離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，然后加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育20 min，使用貝克曼CytomicsTMFC 500流式細胞儀進行檢測。

2 結果

2.1 PRRSV感染PAM細胞產生2種分子大小不同的TNFR1 分別以接種PRRSV HuN4株24 h和沒有任何做處理的PAM細胞提取的總RNA反轉錄產物cDNA為模板，利用表1中的上下游引物進行PCR反應擴增目的片段，PCR產物進行瓊脂糖電泳結果如圖1所示， 從PRRSV HuN4株感染的PAM細胞中擴增產生2條大小不同的DNA條帶，而從陰性對照PAM細胞中擴增只產生1條帶。

2.2TNFR1和TNFR1-d3測序結果及分析 從PRRSV HuN4株感染的PAM細胞中擴增產生2條大小不同的DNA條帶 (TNFR1和TNFR1-d3),膠回收后，用KpnI和EcoR I雙酶切連接到pcDNA3.1(+)中，重組質粒測序比對后得到圖2結果，發現較小的目的條帶TNFR1-d3和較大的目的條帶TNFR1相比，缺失129 bp堿基。進一步分析測序結果發現，缺失的129 bp是TNFR1的第3外顯子上，如圖3。

圖1 PRRSV感染PAM細胞產生2種分子 大小不同的TNFR1Fig.1 Two different sizes of TNFR1 in PAMs infected with PRRSV

圖2TNFR1和TNFR1-d3測序結果比對
Fig.2 Sequence alignment of theTNFR1 andTNFR1-d3

圖3TNFR1-d3缺失位置
Fig.3 Deletion of theTNFR1-d3

2.3 pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3轉染細胞后表達情況 將構建好的真核表達質粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3分別轉染至HEK293細胞中，于轉染后24 h，裂解細胞收集蛋白樣品，進行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉印到PVDF膜上， Western Blot檢測結果顯示,pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3都能正常表達(圖4)。

圖4 pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3重組質粒的表達
Fig.4 Expression of recombinant plasmidspcDNA3.1-TNFR1 and pcDNA3.1-TNFR1-d3

2.4 TNFR1和TNFR1-d3在TNFα誘導細胞凋亡中的作用 將構建好的真核表達質粒pcDNA3.1-TNFR1 和pcDNA3.1-TNFR1-d3分別轉染至HEK293細胞中，于轉染后24 h用TNF-α結合放線菌酮處理細胞，誘導細胞凋亡。用FITC標記的Annexin V作為探針，標記磷脂酰絲氨酸(Phosphotidylserine，PS)來檢測細胞早期凋亡的發生。流式細胞術檢測結果顯示，與對照組(Untreat)相比，過表達TNFR1細胞的凋亡比例明顯升高，而過表達TNFR1-d3細胞的凋亡比例與對照組(Untreat)相比幾乎沒有變化(圖5)。結果表明，TNFR1具有明顯的促凋亡功能，而當TNFR1缺失第3外顯子后其促凋亡能力消失。

圖5 流式細胞檢測TNFR1和TNFR1-d3 在細胞凋亡中的作用Fig.5 Flow cytometry detects the function of TNFR1 and TNFR1-d3 in apoptosis

3 討論

病毒會在感染的早期通過不同的機制抑制宿主細胞的凋亡，促進自身的復制；在感染的晚期促進細胞的凋亡，有助于病毒粒子的釋放。已報道的研究指出，PRRSV在感染的過程中也有類似的現象存在[6-7]。TNFR1是介導細胞凋亡的主要受體分子之一。本研究發現在PRRSV感染后，可以引起PAM細胞TNFR1出現2種不同剪接體：野生型TNRF1和缺失型TNFR1-d3。這2種剪接體的差異在于TNFR1-d3較野生型TNRF1在第3外顯子(129 bp)處缺失，這種缺乏第3外顯子的剪切體TNFR1-d3是第一次被發現。已有文獻報道TNFR1存在缺乏第2外顯子的剪切突變體TNFR1-d2，其存在具有組織特異性[8]。另有研究指出，TNFR1存在缺失第6外顯子的替代轉錄本TNFR1-d6，該種轉錄本不能引起NF-κB介導的細胞凋亡[9]。TNFR1是I型跨膜蛋白，由N端胞外結構域(與TNF結合的部位)，α螺旋跨膜結構域、近膜區和C端胞內死亡結構域組成。C端胞內區可以與細胞內的接頭蛋白TRADD或FADD/MORT1結合形成凋亡復合物引發細胞凋亡[10]。由于TNFR1的第3外顯子位于N端胞外區，是與TNF結合的部位，因此我們推測缺失129 bp 的TNFR1-d3可能會影響由TNFR1介導的細胞凋亡的功能。結果顯示，過表達TNFR1會引起TNFα誘導的細胞凋亡，而過表達TNFR1-d3幾乎失去了由TNF-α處理誘導細胞凋亡的能力。這就說明PRRSV感染可能啟動某種機制，使得TNFR1缺失第3外顯子轉錄本產生，降低細胞凋亡的產生，進而促進病毒的感染復制。本研究闡明了PRRSV在早期抑制細胞凋亡的一種機制。