豬Delta冠狀病毒和豬流行性腹瀉病毒雙重RT-PCR診斷方法的建立

劉 瑩,賈敬亮,劉 濤,袁廣富,陳少杰,王 晶,范京惠,左玉柱

(1.河北農業大學動物醫學院,河北保定071001 ； 2.衡水市畜牧技術推廣站,河北衡水053000 ； 3.石家莊市動物衛生監督所,河北石家莊050000)

豬Delta冠狀病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)和豬流行性腹瀉病毒(Porcire epidemic diarrhea virus, PEDV)均是引起仔豬腹瀉病的重要病原，二者臨床癥狀極為相似，且常?；旌细腥荆瑑H根據臨床上的方法較難進行鑒別與診斷，傳統檢測方法最大的缺點就是檢測周期長，工作繁瑣并配備專業人員進行檢測，特異性與靈敏度也較差，因此，建立一種同時檢測PDCoV和PEDV的快速檢測方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病毒來源 豬流行性腹瀉病毒、豬Delta冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬博卡病毒(PBoV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)陽性病料，均由河北農業大學動物醫學院預防獸醫實驗室鑒定、保存。

1.2 儀器與試劑 DL-2 000 DNA Marker(MD114)、RT-PCR反轉錄試劑盒，均為寶日醫生物技術(北京)有限公司產品；DNA提取試劑盒為北京全式金生物技術有限公司產品；2×TaqPCR Mix為中科瑞泰生物科技有限公司產品；Protein simple凝膠成像系統為普諾森生物科技(上海)有限公司產品。

1.3 引物設計與合成 利用 Primer 5.0 引物設計的軟件，根據GenBank中收錄的PEDVM基因和PDCoVM基因中獲得的保守區域分別設計2對引物，預計擴增PEDV的M基因部分片段520 bp，擴增PDCoV的M基因部分片段340 bp，引物由北京三博遠志生物技術有限責任公司合成(見表1)。

表1 PEDV與PDCoV引物信息Table 1 Primer used for amplification and sequencing of PEDV and PDCoV

1.4 病毒核酸的提取及cDNA的獲取 由河北農業大學動物醫學院預防獸醫實驗室鑒定保存的病毒陽性病料，參照RNA提取試劑盒說明書進行病毒核酸的提取，并使用RT-PCR反轉錄試劑盒獲得cDNA。

1.5 PDCoV和PEDV單一PCR擴增 用1.4中所得到的PEDV和PDCoV的cDNA作為模板進行單一RT-PCR擴增的體系為：2×TaqPCR Mix 10 μL，ddH2O 6 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL。PCR反應擴增程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃再延伸10 min，擴增好的PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，得到目的條帶并進行回收，將回收的目的片段連接至pMD19-T載體并轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α，用質粒提取試劑盒進行提取后，放于-20 ℃保存備用。

1.6 PDCoV與PEDV的雙重RT-PCR擴增 根據1.5中單一RT-PCR的擴增反應條件，以PDCoV和PEDV的重組質粒為模板，通過對退火溫度、引物終濃度、反應體積進行優化，并按上述方法進行凝膠電泳鑒定。

1.7 雙重RT-PCR特異性試驗 分別對PRV、PBoV、TGEV和PRRSV的核酸進行PCR擴增，利用本試驗PDCoV和PEDV的反應體系進行PCR擴增，并在凝膠電泳中進行擴增特異性的驗證。

1.8 PDCoV和PEDV單一和雙重RT-PCR敏感性試驗 將PDCoV和PEDV的單一質粒，測定濃度后，進行10倍倍比稀釋，分別作為模板，驗證單一及雙重RT-PCR檢測方法的敏感性。

1.9 臨床樣品檢測 2018年以來,本實驗室收集到的232份河北各地市養豬場仔豬腹瀉部分樣品進行檢測，用此雙重RT-PCR的檢測方法從仔豬腹瀉病料中進行特異性的檢測，并將雙重RT-PCR和單一RT-PCR進行結果對比。

2 結果

2.1 PDCoV和PEDV的RT-PCR特異性擴增 以PDCoV和PEDV的重組質粒和單一質粒分別作為模板，再分別以TGEV、PRRSV、PBoV和PRV為模板，利用本試驗PDCoV和PEDV的反應體系進行PCR擴增，結果僅PDCoV和PEDV能擴增出特異性條帶，而其他病毒均無特異性條帶(見圖1)。

2.2 單一和雙重 RT-PCR 敏感性試驗 以PDCoV和PEDV的重組質粒進行倍比稀釋后作為模板，用此雙重RT-PCR檢測方法進行檢測，結果顯示，單一PCR對PDCoV和PEDV最低檢測量分別為3.27×103拷貝/μL，3.63×104拷貝/μL(見圖2)。

2.3 多重PCR的臨床檢測 2018年以來，本實驗室收集到的232份河北各地市養豬場仔豬腹瀉樣品進行檢測，臨床樣品的檢測結果顯示(見表2)，在232份未知樣品中，PDCoV的陽性樣品41份，陽性率為17.67%；PEDV的陽性樣品62份，陽性率為26.72%；PDCoV和PEDV的陽性樣品28份，陽性率為12.07%，所建立雙重RT-PCR的檢測方法可以從仔豬腹瀉病料中特異性的檢測出PDCoV和PEDV，并將雙重RT-PCR和單一RT-PCR進行結果對比，檢測結果相一致，符合率100%。

圖1 雙重RT-PCR的特異性試驗
Fig.1 Specificity of the duplex RT-PCR products ofPDCoV and PEDV detectionM：DNA分子質量標準； 1: PEDV和PDCoV的雙重PCR擴增產物； 2:PDCoV的PCR擴增產物； 3: PEDV的PCR擴增產物； 4～7:分別為TGEV、PRRSV、PBOV、PRV的PCR擴增產物
M: DL-2 000 DNA Marker; 1: The duplex PCR products of PDCoV and PEDV; 2: The PCR products of PDCoV; 3: The PCR products of PEDV; 4～7: The PCR products of TGEV, PRRSV, PBoV, PRV

圖2 雙重RT-PCR的敏感性試驗
Fig.2 Sensitivity test of duplex RT-PCR
M: DNA分子質量標準； 1～7:1×10-1～1×10-7拷貝/μL
M: DL-2000 DNA Marker; 1～7: 1×10-1～1×10-7copies/μL

3 討論

豬Delta冠狀病毒是一種新發現的冠狀病毒, 在臨床上主要影響仔豬出現嘔吐、腹瀉和脫水等癥狀，與PEDV癥狀極為相似。2012年Woo等[1]在香港首次檢測出了PDCoV，美國于2014年在腹瀉的仔豬和母豬中首次發現了PDCoV[2]，此后PDCoV在韓國和加拿大也相繼發現和報道了PDCoV[3]。隨后Dong等[4]對2004-2014年安微、廣西、湖北、江蘇4個地區病料的檢測中發現，2004年的病料中就存在PDCoV，并且在國內外均有比較高的檢出率，給散養戶或規模性養豬業造成了巨大危害。豬流行性腹瀉病毒在歐洲和亞洲等規?；B豬行業較發達的地區都有過相關報道[5-9]。1971年在英國首次報道了PEDV，我國從20世紀80年代初開始陸續有 PEDV 的發生。1991年國際病毒分類委員會(ICTV)第5次報告將PEDV列為冠狀病毒屬的可能成員,1991年第6次報告將其列為冠狀病毒屬的正式成員[10]。

表2 臨床樣品檢測結果Table 2 Clinical sample test results

豬Delta冠狀病毒與豬流行性腹瀉病毒感染極為類似,且混合感染時有發生,單靠臨床診斷很難區分2種疾病, 給散養戶或規模性養豬業造成了巨大危害。因此，建立同時檢測且區分PDCoV和PEDV的檢測方法具有重要的臨床意義。根據GenBank 中 PDCoV和PEDV的基因序列保守區，分別對于PDCoVM基因和PEDVM基因設計了2對引物，并對PDCoV和PEDV保守性極高的M基因片段進行擴增，并通過對反應條件的優化，建立了同時檢測PDCoV和PEDV的雙重PCR檢測方法，該方法對于PDCoV和PEDV的最低檢測量分別是3.27×103拷貝/μL和3.63×104拷貝/μL，并且具有良好的特異性和敏感性，進一步在實踐中驗證此方法的可靠性，為獸醫臨床診斷及監測、流行病學的調查提供了理論基礎。很多專家學者對各種腹瀉病已經有了相關研究，任玉鵬等[11]建立了PDCoV、TGEV和PEDV多重RT-PCR方法。劉玲玲等[12]也建立了PDCoV和TGEV的雙重RT-PCR檢測方法。

本試驗是根據近年來河北各地市及其周邊地市養豬場仔豬腹瀉病毒病的流行病學的調查，選取了在目前仔豬腹瀉病中感染率比較高的2種腹瀉病毒病-

豬Delta冠狀病毒(PDCoV)和豬流行性腹瀉(PEDV)進行研究，從而建立2種病毒的雙重RT-PCR檢測方法。