新疆南疆某規(guī)模牛場牛傳染性鼻氣管炎PCR鑒定與分析

張迎春,經(jīng)春林,趙玉賓,王哲紅,黃 騰,胡建軍

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第一師畜牧獸醫(yī)工作站,新疆阿拉爾843300 ； 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第一師四團畜牧獸醫(yī)工作站,新疆阿拉爾843300 ； 3. 塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾843300)

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis, IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus, IBRV)或稱牛皰疹病毒1型(Bovine herpes virus 1, BHV-1)所引起的牛的一種接觸性傳染病。臨床主要表現(xiàn)為上呼吸道炎癥、鼻炎、竇炎、高熱、呼吸困難、流鼻液等，亦可引起母牛流產(chǎn)和死胎、腸炎、小牛腦炎，以及結(jié)膜炎、乳房炎等病癥，新生犢牛可為全身性疾病，并可有腦炎。該病毒侵入牛體后會在三叉神經(jīng)節(jié)和腰、薦神經(jīng)節(jié)內(nèi)形成潛伏感染，中和抗體對潛伏感染病毒無作用，導(dǎo)致持續(xù)性感染。在應(yīng)激因素作用下，潛伏于三叉神經(jīng)節(jié)和腰、薦神經(jīng)節(jié)中的病毒可以活化，并出現(xiàn)于鼻液與陰道分泌物中，隱性帶毒牛成為最危險的傳染源，給本病防治和凈化帶來極大困難[1-3]。

IBR是牛的重要傳染病之一，給養(yǎng)牛業(yè)帶來極大的經(jīng)濟損失。IBR在世界各國都有發(fā)生和存在。近年來，隨著新疆奶牛業(yè)的發(fā)展，IBR發(fā)病率呈上升趨勢，快速鑒定新疆南疆規(guī)模牛場IBR病原，對該病綜合防治工作具有重要意義。本試驗應(yīng)用PCR方法，在規(guī)模牛場開展IBR疾病檢測，為該病的綜合防治工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源 新疆南疆某規(guī)模化牛場部分奶牛出現(xiàn)漿液性或膿性的鼻液，體溫較高、咳嗽、食欲減退。無菌棉簽采集病牛鼻腔分泌物樣品15份，冷凍保存?zhèn)溆谩＝?jīng)調(diào)查該奶牛場未免疫接種牛傳染性鼻氣管炎病毒疫苗。

1.2 主要試劑 血液/細胞/組織DNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、DNA凝膠回收試劑盒、pGM-T克隆試劑盒、TIANgel Midi Purification Kit試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 牛傳染性鼻氣管炎病毒參考毒株 文章中涉及的病毒參考株均下載于NCBI中GenBank，見表1。

表1 GenBank中登錄的IBRV參考株序列Table 1 IBRV reference strains from GenBank

1.4 方法

1.4.1 樣品處理 滅菌棉簽蘸取患牛鼻腔分泌物，置于5 mL離心管PBS緩沖液(濃度)中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 樣品DNA提取 將樣品材料反復(fù)凍融3次，參照血液/細胞/組織DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 引物 采用世界動物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的PCR方法[4]，IBRV特異性gB基因引物序列如下：gB-P1：5′-TACGACTCGTTCGCGCTCTC-3′；gB-P2：5′-GGTACGTC-TCCAAGCTGCCC-3′，預(yù)計擴增片段大小為478 bp，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.4 PCR反應(yīng) 50 μL反應(yīng)體系：Go Tap Green Master Mix 25 μL，引物gB-P1、gB-P2各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 18 μL混勻后瞬時離心。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min， 65 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，10個循環(huán)；95 ℃變性1 min， 54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，15個循環(huán)；95 ℃ 變性1 min， 60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，10個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定所擴增片段大小。

1.4.5 PCR產(chǎn)物純化回收、克隆及測序 DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物并連接到pGEM-T 載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌得到重組菌，菌落PCR鑒定，陽性菌落搖菌，提取質(zhì)粒。樣品送至北京金锘銳杰基因科技有限公司測序。

1.4.6 序列分析 測序結(jié)果在NCBI中進行Blast，利用DNASTAR軟件對測序樣本與GenBank參考株gB基因的核苷酸同源性進行比較分析，并繪制遺傳進化樹。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增 采用IBRVgB基因特異性引物(gB-P1/gB-P2)進行PCR擴增，電泳得到478 bp大小的片段，與預(yù)期的目的片段大小相符(圖1)。

2.2gB基因核苷酸同源性分析 所測樣本序列與牛傳染性鼻氣管炎病毒參考株gB基因片段進行核苷酸同源性比較。3個陽性樣本之間核苷酸同源性達到99%以上，將其中1個陽性樣本序列提交到NCBI中GenBank，獲得登錄號：KY348790，命名為IBRV-4T3-1。IBRV-4T3-1與參考株gB基因核苷酸同源性為86%以上，見表2。

圖1 IBRV-Aks-01株的PCR鑒定
Fig.1 PCR amplification for IBRV-Aks-01M：DNA Marker DL-2 000； 1：PCR陰性對照； 2～4：PCR擴增片段 M：DL-2 000 DNA marker； 1：PCR negative control； 2～4：PCR amplified fragments

表2 IBRV-4T3-1株gB基因核苷酸同源性比較
Table 2 Homology analysis ofgBgene sequence of IBRV-4T3-1

注：右上列值為gB基因核苷酸同源性比較

2.3 IBRV-4T3-1gB基因遺傳進化樹分析 IBRV-4T3-1與參考株gB基因序列核苷酸同源性比較分析并構(gòu)建遺傳進化樹，如圖2所示。IBRV-4T3-1與NYK-Yak-63、BoHV-1-1643-12、Cooper、NM06、BH81、674-10、SP1777、166-84、BHV1.1/2008/MN2/USA、BHV-1-UPR-29/07、BHV1.1/Abu-Hammad/1/2013/Egypt、Banffshire 82、Odocoileus_hemionus_00_1、Salla 82參考毒株同源性為88.8%以上，均屬于α皰疹病毒亞科(Alphaherpesvirus)水痘病毒屬(Varicellovirus)。

3 討論

通過對該規(guī)模牛場的奶牛發(fā)病情況、臨床癥狀等做出初步診斷，結(jié)合PCR鑒定，確定該牛場奶牛感染牛傳染性鼻氣管炎。15份疑似IBR樣本經(jīng)PCR法檢測，核酸陽性檢出率為20%。

20世紀(jì)50年代美國首先報道了IBR，我國于20世紀(jì)70年代從進口種牛中發(fā)現(xiàn)此病。目前世界各地已普遍存在，我國大部分地區(qū)各種牛群中均有不同程度感染。新疆多位學(xué)者[5-11]已開展了牛傳染性鼻氣管炎流行病學(xué)調(diào)查、病原檢測等研究，通過大量研究證實，該病已在新疆牛場普遍存在，部分牛場抗體陽性率可達到90%，不僅奶牛感染，而且牦牛也存在感染的情況，對牛的育肥、繁殖力、產(chǎn)奶量等影響較大。

目前，世界各地的牛傳染性鼻氣管炎病毒分離株只有1個血清型。BHV-1分為3個基因亞型。其中，BHV-1.1 與牛傳染性鼻氣管炎(IBR)有關(guān)，BHV-1.2與傳染性膿皰性外陰-陰道炎(IPV)有關(guān)，而腦炎與BHV-1.3有關(guān)。該病的各型中，在急性病時或地方流行后數(shù)周可出現(xiàn)流產(chǎn)。腦炎型的常感染小于3月齡并且體內(nèi)抗體效價低的犢牛。

IBRV致病性最主要特點是多組織嗜性，常侵害于呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和眼結(jié)膜。病變組織、分泌物內(nèi)含大量病毒，通過空氣、媒介物以及直接接觸而傳播。秋、冬季是本病高發(fā)季節(jié)，過分擁擠、密切接觸的舍飼奶牛群中易迅速傳播[1]。

圖2 牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因系統(tǒng)進化樹
Fig.2 Phylogenetic tree inferred from thegBgene nucleotide sequences of IBRV

嚴(yán)格檢疫是防止引入傳染源的最重要措施。發(fā)現(xiàn)疑似病牛，應(yīng)隔離觀察，控制并發(fā)癥。流行較嚴(yán)重的地區(qū)，可用疫苗控制，疫苗雖不能防止感染，但可起到防御臨診發(fā)病的效果。在發(fā)病率低的地區(qū)，采用檢出陽性病牛予以淘汰，是根除本病的有效途徑。如補償機制不全，實施難度較大[3]。目前，丹麥和瑞士采用禁止使用傳染性牛鼻氣管炎病毒疫苗而采取撲殺抗體陽性牛的措施，使得該病在這2個國家?guī)缀醣粨錅鏪1]。

IBR在自然感染時，隱性感染不表現(xiàn)出臨床癥狀，而重癥病牛則表現(xiàn)急性上呼吸道癥狀，僅依據(jù)臨床表現(xiàn)很難進行確診。IBRV基因組中g(shù)B(UL27)位于基因組的長獨特區(qū)，是IBRV強毒、弱毒所共有且比較保守的序列，PCR方法可用于疑似感染IBR或潛伏感染患牛的檢測。本試驗采用PCR法進行IBR檢測，為新疆南疆地區(qū)規(guī)模牛場感染IBR綜合防控措施的制定提供了可靠依據(jù)。