吳茱萸次堿通過調(diào)控表皮生長因子受體活化抑制高血壓心肌肥大

嚴秋江，范秀晶，楊 妍，楊水源，梁金成，曾泗宇*

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院心胸外科心內(nèi)二區(qū)，廣東 廣州 510000；2.廣東省第二人民醫(yī)院藥學部，廣東 廣州 510317)

高血壓是常見的心血管疾病。心肌肥大是高血壓發(fā)展為心力衰竭的基本機制，其發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)(如交感神經(jīng)系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng))及表皮生長因子受體功能失調(diào)有關(guān)。盡管血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、鈣拮抗劑等已用于心力衰竭的治療，但心衰患者病死率仍居高不下。因此，抑制高血壓心肌肥大，對阻止或延緩高血壓發(fā)展為心力衰竭具有重要的臨床價值。

廣東是我國傳統(tǒng)中藥吳茱萸(包括蕓香科植物吳茱萸和疏毛吳茱萸)的重要產(chǎn)地。文獻報道，吳茱萸次堿作為吳茱萸的活性單體，可劑量依賴性地降低腎性高血壓大鼠血壓，其機制與其刺激降鈣素基因相關(guān)肽的釋放有關(guān)[1]。研究顯示，吳茱萸次堿可抑制異丙腎上腺素介導的左心室心肌肥大[2]。課題組前期研究顯示，吳茱萸次堿可抑制腹主動脈縮窄(abdominal artery constriction，AAC)介導的高血壓大鼠的心肌肥大，其機理涉及NADPH氧化酶Nox4-活性氧-解整合素金屬蛋白酶17通路[3]。上述研究表明中藥單體藥吳茱萸次堿具有抗高血壓心肌肥大效應(yīng)，但其機理尚未完全闡述清楚。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)活化與高血壓心肌肥大的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但尚未揭示其與吳茱萸次堿的抗高血壓心肌肥大效應(yīng)的關(guān)系。本研究擬以AAC介導的高血壓大鼠為研究對象，闡明吳茱萸次堿對高血壓引起的心肌肥大的抑制作用及其相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吳茱萸次堿和選擇性EGFR抑制劑AG1478分別購自成都曼斯特生物科技有限公司和D&C Chemicals。RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，基因引物購于上海生物工程技術(shù)有限公司。p-EGFR抗體和EGFR抗體購于Abcam公司，細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase，ERK1/2)的磷酸化和非磷酸化抗體購于Cell Signaling Technology公司。白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白介素6(interleukin 6, IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)的酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司。

1.2 AAC介導的高血壓大鼠模型的構(gòu)建

SPF級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠75只(體重180～220 g)，購于中山大學動物實驗中心。參照課題組前期方法[4]完成了AAC介導的高血壓大鼠模型的構(gòu)建，假手術(shù)組(Sham)組大鼠除未造成腹主動脈狹窄外，其他與手術(shù)組操作相同。術(shù)后三天連續(xù)腹腔注射慶大霉素預防感染；術(shù)后1天內(nèi)有10%大鼠死亡，補做手術(shù)以確保每組動物數(shù)量為10只。吳茱萸次堿處理分組如下：假手術(shù)組，AAC模型組，AAC+吳茱萸次堿低劑量(20 mg/kg)組[AAC+Rut(L)]，AAC+吳茱萸次堿高劑量(40 mg/kg)組[AAC+Rut(H)]，術(shù)后第2天開始灌胃給藥，連續(xù)給藥4周。EGFR選擇性抑制劑AG1478分組如下：假手術(shù)組，AAC模型組，AAC+AG1478(20mg/kg)組，術(shù)后第2天開始腹腔注射給藥，連續(xù)給藥4周。

1.3 心肌肥大相關(guān)參數(shù)的檢測

用異氟烷(2%)吸入麻醉大鼠并剃除胸部毛，然后在心臟乳頭肌水平用M型超聲心動圖成像檢測(探頭頻率為8.5 MHz)左室前壁厚度(left ventriculr anterior wall thickness, LVAW)、左室后壁厚度(left ventriculr posterior wall thickness，LVPW)、左心室舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular internal diameter during diastole，LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular internal diameter during systole，LVIDs)等心臟參數(shù)。

行超聲心動圖檢查后，用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg，臨用前現(xiàn)配)腹腔注射麻醉大鼠，然后將連通壓力傳感器的導管(充滿肝素)插入至左心室；連接的BL-420S生物信號記錄儀連續(xù)記錄5 min血壓。取一段平穩(wěn)的血壓曲線，通過生理分析軟件記錄主動脈收縮壓(Aosp)、主動脈舒張壓(Aodp)、左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(maximal ascending and declining rate of left ventricular pressure，dp/dtmax)和心率(heart rate，HR)。隨后腹腔靜脈注射氯化鉀注射液(2M)以確保大鼠心臟停留于舒張期，迅速打開胸腔，取出心臟；用預冷的PBS溶液充分灌注并沖洗出心腔殘血，然后用電子天平稱心臟重量(heart weight，HW)和左心室重量(left ventricular weight，LVW)，分別計算心重體重比(HW/BW)、左心室重指數(shù)(LVW/BW)。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)

剪取15～20 mg大鼠心肌組織放入EP管中，用手術(shù)剪將組織剪成小塊，加入1 mL Trizol后用組織勻漿機將組織勻碎，4 ℃，12 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至一新EP管中，然后按照試劑盒操作步驟提取總RNA以及進行逆轉(zhuǎn)錄和實時定量聚合酶鏈反應(yīng)。腦利尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)、β-肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain β, β-MHC)、IL-1β、IL-6和TNF-α，及內(nèi)參GADPH等基因引物見表1。

表1 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)的引物序列

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法

剪取15～20 mg大鼠心肌組織放入EP管中，用手術(shù)剪將組織剪成小塊，加入蛋白裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)，然后提取組織蛋白并檢測EGFR和ERK1/2的磷酸化蛋白水平和總蛋白水平，具體方法見課題組前期研究方法[4]。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實驗

ELISA檢測大鼠心肌組織中促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α，具體方法見課題組前期研究方法[5]。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 吳茱萸次堿對AAC介導的高血壓大鼠血壓的影響

術(shù)前各組大鼠收縮壓無明顯差異；同假手術(shù)組比較，術(shù)后4周AAC組大鼠主動脈收縮壓和主動脈舒張壓顯著增加(表2)。上述結(jié)果提示，AAC介導的高血壓大鼠模型構(gòu)建成功。吳茱萸次堿干預4周后，AAC介導的高血壓大鼠主動脈收縮壓、主動脈舒張壓顯著降低。上述研究證實了吳茱萸次堿對AAC介導的高血壓大鼠的降壓效應(yīng)。

表2 吳茱萸次堿對AAC介導的高血壓大鼠血流動力學參數(shù)的影響

2.2 吳茱萸次堿對AAC介導的高血壓大鼠心肌肥大的影響

同Sham組比較，術(shù)后4周，高血壓大鼠左室前壁厚度(LVAW)、左室后壁厚度(LVPD)、HW/BW、LVW/BW以及左心室BNP和β-MHC表達水平顯著增加，提示AAC介導的高血壓大鼠發(fā)生了明顯的心室肥厚。同AAC組比較，吳茱萸次堿低劑量組和高劑量組均可顯著降低左室前壁厚度(LVAW)、左室后壁厚度(LVPD)、HW/BW、LVW/BW以及左心室BNP和β-MHC表達水平(表3)。因此，吳茱萸次堿能顯著削弱AAC介導的高血壓大鼠心肌肥大。

表3 吳茱萸次堿對AAC介導的高血壓大鼠心肌肥大的影響

2.3 吳茱萸次堿對AAC介導的高血壓大鼠左心室中EGFR和ERK1/2活化的影響

同Sham組比較，高血壓模型組大鼠左心室EGFR和ERK1/2磷酸化水平顯著增加；給予低劑量和高劑量的吳茱萸次堿干預4周，均能顯著降低AAC介導的高血壓大鼠左心室EGFR和ERK1/2磷酸化水平(圖1)。

圖1 吳茱萸次堿抑制AAC介導的高血壓大鼠左心室EGFR和ERK1/2活化1：假手術(shù)組；2：AAC模型組；3：AAC+Rut(L)；4：AAC+Rut.A：EGFR磷酸化水平；B：ERK1/2磷酸化水平與假手術(shù)組比較,*P<0.05；與AAC模型組比較，#P<0.05(n=3)

2.4 吳茱萸次堿對AAC介導的高血壓大鼠左心室炎癥反應(yīng)的影響

同Sham組比較，AAC介導的高血壓大鼠左心室中促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平和蛋白水平顯著增加；同高血壓模型組比較，低劑量和高劑量的吳茱萸次堿處理4周后，AAC介導的高血壓大鼠左心室中促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達顯著下降(圖2)。因此，吳茱萸次堿能顯著改善高血壓大鼠心肌炎癥反應(yīng)。

2.5 選擇性EGFR抑制劑AG1478削弱AAC介導的高血壓大鼠左心室肥大

術(shù)前各組大鼠收縮壓無明顯差異，術(shù)后4周AAC大鼠主動脈收縮壓和主動脈舒張壓均顯著增加，而選擇性EGFR抑制劑AG1478干預4周并未明顯改變AAC大鼠血壓，但能降低AAC介導的高血壓大鼠左室前壁厚度(LVAW)、左室后壁厚度(LVPD)、HW/BW、LVW/BW以及左心室BNP和β-MHC mRNA的表達水平(表4)。上述結(jié)果表明，EGFR抑制通過不依賴血壓調(diào)控的方式改善高血壓介導的心肌肥大。

表4 選擇性EGFR抑制劑對AAC介導的高血壓大鼠血流動力學參數(shù)和心肌肥大的影響

2.6 AG1478抑制AAC介導的高血壓大鼠左心室炎癥反應(yīng)和ERK1/2活化

同Sham組比較，AAC介導的高血壓大鼠左心室中促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平和蛋白水平以及ERK1/2活性顯著增加；同AAC組比較，AG1478處理4周能顯著降低AAC介導的高血壓大鼠左心室中上述參數(shù)(圖3和圖4)。因此，抑制EGFR活化能顯著削弱AAC介導的高血壓大鼠心肌炎癥反應(yīng)和ERK1/2活化。

圖3 選擇性EGFR抑制劑AG1478降低AAC介導的高血壓大鼠左心室ERK1/2磷酸化水平1：假手術(shù)組；2：AAC模型組；3：AAC+AG1478.A：EGFR磷酸化水平；B：ERK1/2磷酸化水平.與假手術(shù)組比較,*P<0.05；與AAC模型組比較，#P<0.05(n=3)

圖4 選擇性EGFR抑制劑AG1478抑制AAC介導的高血壓大鼠心肌炎癥反應(yīng)1：假手術(shù)組；2：AAC模型組；3：AAC+AG1478.A-C：左心室促炎癥因子IL-1β(A)、IL-6(B)和TNF-α(C)蛋白水平(n=6);D:左心室促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平(n=3).與假手術(shù)組比較,*P<0.05；與AAC模型組比較，#P<0.05

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，(1)吳茱萸次堿能顯著改善AAC介導的高血壓大鼠心肌肥大和心肌炎癥反應(yīng)；(2)吳茱萸次堿能抑制AAC介導的高血壓大鼠左心室EGFR和ERK1/2的活化；(3)抑制EGFR能改善AAC介導的高血壓大鼠心肌肥大和心肌炎癥反應(yīng)，抑制ERK1/2活化。

EGFR與高血壓心肌肥大的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。靶向敲除平滑肌細胞中EGFR并不能改變小鼠收縮壓，但能降低外周血管阻力、舒張壓和平均動脈壓[6]。我們的研究結(jié)果顯示，抑制EGFR未能降低AAC介導的高血壓大鼠收縮壓和舒張壓。這說明EGFR活化在生理條件下，能調(diào)控外周血管阻力壓，但在病理條件下并不能改變血壓。課題組前期在原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中研究發(fā)現(xiàn)，EGFR活化可促進血管緊張Ⅱ介導的心肌肥大[7]。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，EGFR抑制劑能顯著改善血管緊張素I介導的高血壓心肌肥大[8]。此外，心臟局部注射慢病毒包被的EGFR shRNA能顯著削弱自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥大[9]。體內(nèi)研究證據(jù)與本研究結(jié)果一致：選擇性EGFR抑制劑AG1478顯著削弱了AAC介導的高血壓大鼠左心室肥大。上述研究表明，EGFR是誘導高血壓心肌肥大的重要機制，且其調(diào)控不依賴血壓改變。

ERK1/2在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究表明MEK1通過直接誘導L-蘇氨酸-谷氨酸-酪氨酸模序磷酸化而激活ERK1/2。MEK1轉(zhuǎn)基因小鼠模型發(fā)現(xiàn)，生理條件下MEK1通過ERK1/2活化誘導代償性心肌肥大[10]，提示一定程度的ERK1/2活化對維持心肌生理功能的必要性。在胸主動脈縮窄介導的高血壓小鼠模型中，ERK2基因敲除可顯著削弱高血壓心肌肥大[11]，但Nicole HP等[12]報道截然不同的結(jié)果：ERK1/2基因抑制并不能抑制胸主動脈縮窄介導的高血壓心肌肥大。這種差異可能是由于基因敲除方法不同造成的。研究表明，通過干擾ERK二聚體形成而抑制細胞核內(nèi)ERK1/2信號通路，從而削弱高血壓心肌肥大[13]。因此，ERK1/2長期以來被認為是促高血壓心肌肥大的重要蛋白。本研究結(jié)果顯示，吳茱萸次堿能顯著改善AAC介導的高血壓大鼠心肌肥大及左心室EGFR、ERK1/2的活化；且抑制EGFR能抑制AAC介導的高血壓大鼠心肌肥大及ERK1/2活化。故吳茱萸次堿通過抑制EGFR-ERK1/2通路削弱AAC介導的高血壓心肌肥大。

流行病學研究顯示，高血壓患者循環(huán)中C反應(yīng)蛋白(c-reactive protein，CRP)、IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子表達水平明顯升高，且循環(huán)中CRP、IL-6表達與血壓水平呈正相關(guān)，說明高血壓是一個炎癥性疾病[14]。在血管緊張素Ⅱ和高鹽誘導的高血壓小鼠中，IL-6體內(nèi)敲除可抑制心室功能紊亂、心肌炎癥和纖維化[15]。IL-6注射可誘導大鼠左心室肥大，增加室壁硬度和心肌間質(zhì)膠原容積分數(shù)[16]。Lai NC等則報道截然不同的結(jié)果：IL-6敲除并不影響胸主動脈縮窄介導的高血壓小鼠心室重構(gòu)[17]。上述結(jié)果的差異可能是由于高血壓模型和基因敲除的方法不同所導致。TNF-α敲除可抑制血管緊張素Ⅱ和胸主動脈狹窄介導的高血壓小鼠心肌肥大和炎癥反應(yīng)，改善心室功能[18-19]。系統(tǒng)敲除IL-1β顯著改善了主動脈狹窄介導的高血壓心肌肥大[20]。上述研究表明，以IL-1β、IL-6和TNF-α為關(guān)鍵因子的炎癥反應(yīng)是高血壓心肌肥大發(fā)生發(fā)展的重要機制。本研究結(jié)果顯示，吳茱萸次堿和選擇性EGFR抑制劑AG1478均能顯著改善AAC介導的高血壓大鼠心肌肥大和心肌炎癥反應(yīng)。

綜上所述，中藥單體藥吳茱萸次堿能通過抑制EGFR活化顯著改善AAC介導的高血壓大鼠心肌肥大，其機制可能與其抑制ERK1/2活化和心肌炎癥反應(yīng)有關(guān)。這將為吳茱萸次堿作為高血壓心肌肥大的治療藥物提供了進一步的理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。