漢黃芩素對2型糖尿病小鼠糖尿病視網膜病變的影響

顏 彥，吳 琳，鄭海龍

(1.海南醫學院第一附屬醫院藥學部，海南 海口 570100；2.海南醫學院熱檢學院，海南 海口 570102；3.海南醫學院第一附屬醫院內分泌科，海南 海口 570100)

隨著我國經濟的飛速發展，人們的高節奏生活及飲食結構的改變，現在我國已經趕超美國成為第一大糖尿病大國[1]。2型糖尿病發展至后期會出現嚴重的并發癥，如糖尿病腎病、糖尿病視網膜病變、糖尿病足等[2-3]。有文獻報道[4-5]，漢黃芩素在人結腸癌細胞中可通過p53誘導癌細胞凋亡，且能夠顯著抑制腫瘤的生長并促進樹突狀細胞、T細胞等在腫瘤組織中的聚集，證實了漢黃芩素的抗腫瘤作用及免疫增強活性。然而，目前漢黃芩素對于2型糖尿病視網膜病變的相關研究較少。目前，已有多數研究[6-8]證實血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)與糖尿病視網膜病變關系密切。本研究從漢黃芩素改善糖尿病人視網膜病變的角度出發，研究其對KK/Upj-Ay小鼠2型糖尿病及糖尿病視網膜病變的改善作用及作用機制，為漢黃芩素治療糖尿病視網膜病變提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

KK/Upj-Ay小鼠(自發性2型糖尿病小鼠)，63只，5周齡；昆明小鼠21只，體質量30～40 g，SPF級，雄性，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK(湘)2011-0003。自購買之日起，適應性飼養1周，期間自由攝食與飲水，適應期內所有小鼠的飼料與飲用水一致。漢黃芩素(生產批號：MUST-11040321純度>98%)，購于成都曼斯特有限公司；鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司，批號：S0130-1g)；鹽酸二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號：AAH5579，規格：0.5 g/片)。檸檬酸(天津市北辰方正試劑廠，批號：20170225)；總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、三酰甘油(TG)試劑盒、空腹胰島素(fasting insulin,FINS)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；VEGF、bFGF、TGF-β試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；BGMS-1血糖儀(長沙三諾生物傳感技術股份有限公司)；專用飼料(北京博愛港商貿中心)；M200PRO型多功能酶標儀為瑞士TECAN公司產品；引物序列由上海生工生物工程公司合成(見表1)。

表1 各引物序列

1.2 動物分組及給藥[9]

KK/Upj-Ay小鼠，5周齡，按照空腹血糖(FBG)水平隨機分組，分別為模型組、漢黃芩素組(6.32 g生藥/kg)、二甲雙胍組(0.1 g/kg)；以正常昆明小鼠為對照組，每組21只。采用灌胃給藥，對照組和模型組給予等體積的蒸餾水，1次/天，連續給藥3個月。

1.3 糖尿病視網膜病變(DR)模型的建立[10-12]

KK/Upj-Ay小鼠連續飼喂專用飼料3個月，每1個月進行一次眼底檢查，糖尿病小鼠出現視網膜出血或新生血管即糖尿病視網膜病變小鼠模型成功。對照組小鼠給予正常飼料飼喂。

1.4 ELISA法

連續給藥3個月后，采用酶聯免疫法(ELISA)四組小鼠在處死前，尾靜脈采血，按照試劑盒說明，測定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量，及血清FINS水平。

1.5 小鼠視網膜VEGF免疫熒光

給藥3個月結束采完血后，隨機取7只小鼠麻醉處死，摘取眼球，固定于10%多聚甲醛液中固定，切片，加入抗VEGF的一抗抗體，室溫孵育1 h，PBS洗三遍，每次5 min。加入二抗，室溫孵育30 min。PBS洗三遍，每次5 min。加入DAPI原液染色5 min，用PBS洗三遍，洗去多余的DAPI，加入20 μL抗熒光淬滅封片劑封片。

1.6 Western blot法

隨機取7只小鼠，剝離小鼠視網膜，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，充分裂解后，低溫離心機4 ℃ 12 000 rpm離心10 min，采用BCA試劑盒進行蛋白定量。將不同濃度的蛋白樣品用PBS稀釋成相同濃度，并加入5×上樣緩沖液，使用10%～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，脫脂奶粉封閉PVDF膜1h，4℃條件下孵育一抗過夜。二抗室溫孵育含蛋白的PVDF膜2h，TPBS洗滌膜3次。采用ECL顯色法，在暗室采用膠片曝光，用Image J軟件分析。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

剩余7只小鼠取視網膜組織，常規方法提取RNA，TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit進行反轉錄：渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的殘留集中到管底。設定PCR程序，42 ℃孵育40 min，85 ℃，5 min。反應結束后，冷卻，cDNA產物置于-20 ℃暫存。采用TaqMan Small RNA Assays進行擴增，用DEPC水補齊至10 μL，加入八聯排管中。混勻，離心，放入PCR儀中，選擇兩步法程序，反應結束后采用相對定量方法進行mRNA水平分析，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。△△Ct計算公式：△△Ct=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組。

1.8 統計學分析

應用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，計量資料數據以均值±標準差表示，多組間均數的比較采用單因素(one-way ANOVA)方差分析，組間兩兩比較采用S-N-K檢驗。當P<0.05時，表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C和FINS含量

如表1所示，四組小鼠HDL-C、TC、LDL-C、TG和FINS的含量差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C、FINS含量顯著升高，漢黃芩素或二甲雙胍能顯著降低TC、TG、LDL-C、FINS含量，升高HDL-C含量。

表1 各組小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、FINS含量比較

2.2 VEGF在小鼠視網膜的分布及表達

通過采用免疫熒光法檢測VEGF在小鼠視網膜的分布及表達情況，結果發現，與對照組比較，模型組視網膜神經節細胞層VEGF呈現高表達(箭頭部分，紅色熒光)，熒長較強。漢黃芩素組和二甲雙胍組相對于模型組熒光明顯的減弱，說明漢黃芩素對小鼠視網膜VEGF的表達有明顯的抑制作用(圖1)。

圖1 各組小鼠熒光染色結果(IF，400×)A：對照組、B：模型組、C：漢黃芩素組、D：二甲雙胍組

2.3 VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達

采用Western blot法檢測了各組小鼠視網膜VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達情況，結果表明，四組小鼠視網膜VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，漢黃芩素組和二甲雙胍組VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達顯著降低(P<0.05)。Western blot結果見圖2，各蛋白的相對密度見表2。

圖2 各組小鼠相關蛋白表達A：對照組，B：模型組，C：漢黃芩素組，D：二甲雙胍組

表2 各組小鼠視網膜中VEGF、bFGF、TGF-β蛋白含量比較

2.4 VEGF、bFGF、TGF-β的mRNA水平

采用qRT-PCR對小鼠視網膜VEGF、bFGF、TGF-β的mRNA水平變化情況進行了檢測，結果發現，四組視網膜VEGF、bFGF、TGF-β mRNA水平比較，差異具有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組VEGF、bFGF、TGF-βmRNA表達顯著增加(P<0.05)。與模型組相比，漢黃芩素組和二甲雙胍組VEGF、bFGF、TGF-β mRNA表達顯著降低(見表3)。

表3 各組小鼠視網膜中VEGF、bFGF、TGF-β mRNA含量比較

3 討 論

糖尿病確切的病因和發病機制尚未完全闡明，對糖尿病的治療已成為需要全人類共同攻克的難題[13]。2型糖尿病到后期會產生嚴重的并發癥。常見的并發癥包括糖尿病視網膜病變、糖尿病腎病、糖尿病足等[14]，建立2型糖尿病視網膜病變小鼠模型是研究糖尿病的理想工具，一個長期、穩定的2型糖尿病視網膜病變小鼠模型，對于進一步研究糖尿病視網膜病變很有必要[15]。本研究采用KK/Upj-Ay小鼠誘發2型糖尿病視網膜病變模型比較穩定、成模率更高。

漢黃芩素是黃芩中的成分，屬于黃酮類化合物，具有抗病毒、抗菌、抗炎、解熱等作用。研究還證實漢黃芩素有降血糖、抗氧化作用[16]。從實驗結果可以看出，漢黃芩素可顯著增加HDL-C的含量，同時降低TC、TG、LDL-C的含量，說明漢黃芩素對小鼠2型糖尿病誘發的高脂血癥具有明顯的治療作用。VEGF、TGF-β、bFGF是眼睛新生血管的形成、血管增生和炎癥形成的主要作用因子。相關實驗表明，VEGF可以促進血管內皮細胞的增殖，形成新生毛細血管。TGF-β可以誘導巨噬和中性粒細胞進行抗炎反應。bFGF則主要和膠原纖維的合成有關。2型糖尿病視網膜病變到后期有大量的炎性細胞浸潤，還會生成大量的新生血管,推測漢黃芩素發揮改善視網膜病變的效應，與VEGF、bFGF、TGF-β等相關。免疫熒光顯示，漢黃芩素能明顯抑制小鼠視網膜VEGF的表達。實驗結果顯示，漢黃芩素對小鼠視網膜病變的VEGF、bFGF、TGF-β蛋白和mRNA表達有下調作用。綜上所述，漢黃芩素對小鼠2型糖尿病視網膜病變的保護作用可能是通過抑制VEGF、bFGF、TGF-β表達起作用。