α-亞麻酸對戊酸雌二醇誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征大鼠的影響

吳美麗，王德瑩，劉 國

(1.青島市婦女兒童醫(yī)院婦科，山東 青島 266011；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，黑龍江 哈爾濱 150080；3.濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦科，山東 濱州 256603)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)屬于異質(zhì)性生殖功能障礙，其常與脂糖代謝異常疾病并存，發(fā)病率約占育齡期婦女的5%～10%[1]。雌激素通過作用于下丘腦和垂體，正反饋調(diào)控LH的分泌，使LH含量呈現(xiàn)持續(xù)高水平，無法形成月經(jīng)中期的LH峰，抑制排卵[2-3]。

α-亞麻酸(Alpha-Linolenic acid, ALA)主要存在于亞麻籽和蘇子中。研究結(jié)果表明[4]，ALA可通過降低氧化應(yīng)激水平促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟，提高胚胎發(fā)育潛能。雄激素分泌增多是造成PCOS生殖紊亂的主要原因之一[5]。相關(guān)研究表明[6]，CYP11A1編碼的膽固醇側(cè)鏈裂解酶是催化雄、雌激素合成的關(guān)鍵限速酶。本研究，通過建立戊酸雌二醇誘導(dǎo)的SD大鼠多囊卵巢綜合征模型，探討ALA對PCOS大鼠性激素水平及卵巢組織形態(tài)的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

6周齡雌性SD大鼠，SPF級，180～220 g，32只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(滬)2018-0005]。對動物的處置符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。

1.2 藥品與試劑

戊酸雌二醇(德國拜耳，國藥準(zhǔn)字J20171038)；ALA(成都德銳可生物科技有限公司)；蘇木素-伊紅染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)和脫氫表雄酮(DHEA)酶聯(lián)免疫(ELISA)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；GAPDH和CYP11A1基因引物序列由上海生物工程有限公司合成(表1)。

表1 各引物序列

1.3 儀器

電子分析天平(上海光學(xué)儀器廠)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific MultiSkan Go)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)；PCR儀(蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司)。

1.4 大鼠多囊卵巢綜合征模型的建立及分組

隨機(jī)選取24只SD大鼠肌肉注射4 mg戊酸雌二醇(溶于0.2 mL油劑中)，連續(xù)注射7周建立PCOS模型[3]。從第50天開始，將造模成功的大鼠隨機(jī)分為三組：模型組(灌胃生理鹽水)、ALA 50 mg/kg組和ALA 200 mg/kg組(分別連續(xù)灌胃50 mg/kg和200 mg/kg ALA 30天)，另選正常雌性大鼠作為對照組(灌胃生理鹽水)，每組8只。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.5.1 卵巢組織稱重 在末次給藥12 h后，大鼠經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉，采血后，迅速剖腹摘取左右兩側(cè)卵巢組織，在電子分析天平上進(jìn)行稱重并記錄。

1.5.2 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 將各組大鼠左側(cè)卵巢組織放入4%多聚甲醛中固定24 h后，進(jìn)行脫水，透明，石蠟包埋，切片(厚度：5 μm)。然后將切片放入60 ℃烘箱中烤3 h，脫蠟水化，水洗1 min，蘇木素染色10 min，水洗1 min，伊紅著色1 min，脫水后中性樹脂封片，光鏡下觀察卵巢組織形態(tài)。

1.5.3 成熟卵泡及黃體數(shù)量統(tǒng)計 每組觀察統(tǒng)計8個卵巢，每個卵巢觀察統(tǒng)計5張HE染色的切片中成熟卵泡及黃體數(shù)量。

1.5.4 血清中性激素含量測定 各組大鼠經(jīng)麻醉后，腹主動脈取血，2 000 r/min離心15 min，將上層血清轉(zhuǎn)入Eppendorf管中，-70 ℃保存?zhèn)溆谩２捎妹嘎?lián)免疫(ELISA)法測定血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)、睪酮(T)和脫氫表雄酮(DHEA)的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5.5 熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的mRNA表達(dá) 采用Trizol試劑法提取各組大鼠卵巢組織中的總RNA，隨后采用相關(guān)試劑盒對樣品RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件是：95 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共計30個循環(huán)反應(yīng)。采用2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量。△△Ct計算公式：△△Ct=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)實(shí)驗(yàn)組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料均服從正態(tài)分布，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素(one-way ANOVA)方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 卵巢組織稱重結(jié)果

由表2可見，與對照組比較，模型組左、右兩側(cè)卵巢組織質(zhì)量均顯著增加。與模型組比較，ALA處理組大鼠左、右兩側(cè)卵巢組織質(zhì)量均顯著降低，且ALA 200 mg/kg組大鼠兩側(cè)卵巢組織質(zhì)量均顯著低于ALA 50 mg/kg組。

表2 各組大鼠左、右兩側(cè)卵巢組織質(zhì)量

2.2 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及分析結(jié)果

由圖1可見，對照組大鼠卵巢組織可見不同發(fā)育程度的卵泡、黃體，顆粒細(xì)胞形態(tài)良好，排列整齊，未見細(xì)胞壞死。模型組大鼠卵巢組織可見囊性卵泡顯著增多，顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)扁平或立方狀，黃體及不同發(fā)育階段的卵泡減少。與模型組大鼠卵巢組織相比，ALA組黃體及不同發(fā)育階段的卵泡數(shù)量明顯增多，顆粒細(xì)胞形態(tài)明顯改善，囊性卵泡明顯減少。50 mg/kg和200 mg/kg ALA兩組卵巢組織形態(tài)改善差異不明顯。

圖1 各組大鼠卵巢組織卵泡、黃體，顆粒細(xì)胞形態(tài)(HE,400×)A:對照組；B模型組;C:50 mg/kg ALA;D:200 mg/kg ALA

2.3 成熟卵泡及黃體數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果

由表3可見，與對照組比較，模型組組大鼠卵巢組織中成熟卵泡及黃體數(shù)量均減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，ALA處理組大鼠卵巢組織中成熟卵泡及黃體數(shù)量均增多，并呈劑量依賴效應(yīng)。

表3 各組大鼠成熟卵泡及黃體數(shù)量 (個)

2.4 大鼠血清中E2、P、T、DHEA含量

如表4所示，與對照組比較，模型大鼠血清中E2、T的含量顯著升高，而P含量顯著降低，給予ALA干預(yù)后，大鼠血清中E2、T含量顯著降低，而P顯著升高，DHEA在各組中無顯著變化。

表4 各組大鼠血清中E2、P、T、DHEA的含量比較

2.5 大鼠卵巢組織CYP11A1 mRNA表達(dá)

統(tǒng)計結(jié)果表明，與對照組相比，模型組大鼠卵巢組織中CYP11A1 mRNA表達(dá)增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，ALA 200 mg/kg組大鼠卵巢組織中CYP11A1 mRNA表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

圖2 各組大鼠卵巢組織CYP11A1 mRNA檢測結(jié)果A：對照組；B：模型組；C組：ALA 50 mg/kg；D:ALA 200 mg/kg與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與ALA 50 mg/kg比較，+P<0.05

3 討 論

本研究采用肌肉注射戊酸雌二醇建立大鼠PCOS模型，血清中性激素含量測定結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中睪酮含量較正常組顯著升高,卵巢組織可見囊性卵泡顯著增多，顆粒細(xì)胞呈現(xiàn)扁平或立方狀，黃體及不同發(fā)育階段的卵泡減少，成熟卵泡數(shù)量減少。上述結(jié)果表明，本研究成功建立戊酸雌二醇誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征大鼠模型。

ALA屬于ω-3脂肪酸，在人體內(nèi)可直接分解為DHA和EPA[7]。ω-3脂肪酸在增加胰島素敏感性、降低高胰島素血癥患者血清中胰島素含量、降低血漿中甘油三酯、減少肝臟脂肪、抑制炎癥及肥胖癥方面，表現(xiàn)出良好的作用[8-10]。Shahnazi等人的研究，發(fā)現(xiàn)ω-3脂肪酸對PCOS患者的生殖系統(tǒng)有積極作用[11]，其中，EPA能夠通過調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞中IGF-1和COX-2的表達(dá)，從而改善PCOS患者的生殖障礙。ALA因其廣泛存在于陸地植物中，如亞麻籽，與EPA相比，原料價格低廉、資源豐富[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，ALA能使PCOS大鼠卵巢組織形態(tài)及成熟卵泡和黃體數(shù)量明顯增多，顆粒細(xì)胞形態(tài)明顯改善，囊性卵泡明顯減少；血清中雌二醇、睪酮含量減少，孕酮含量增多，并有劑量依賴效應(yīng)，說明ALA能明顯改善卵巢機(jī)能。CYP11A1編碼的膽固醇側(cè)鏈裂解酶是催化雄、雌激素合成的關(guān)鍵限速酶[6]，本研究提示，ALA可通過下調(diào)PCOS大鼠卵巢組織中CYP11A1基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制膽固醇側(cè)鏈裂解酶的活化，從而使PCOS大鼠血清中睪酮含量降低。

綜上所述，ALA可明顯改善戊酸雌二醇誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征大鼠卵巢組織形態(tài)及增加卵巢組織質(zhì)量和功能。