伊維菌素上調(diào)自噬水平抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖

刁洪秀,程 楠,張 迪,林德貴

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京海淀100193)

乳腺腫瘤是犬最常見的自發(fā)性腫瘤，尤其是在未絕育的母犬中發(fā)病率更高[1-2]。單純的手術(shù)切除治療無法治愈該疾病，其較高的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率使其預(yù)后很差。自噬作為腫瘤研究熱點(diǎn)，已證實(shí)可參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個(gè)階段，并誘導(dǎo)異常細(xì)胞的凋亡[3-4]。因此，誘導(dǎo)癌細(xì)胞自噬為抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了新的方向[5]。伊維菌素(Ivermectin)是一種常用的抗寄生蟲藥物，近期的研究發(fā)現(xiàn)伊維菌素在多種人類腫瘤中發(fā)揮抗腫瘤活性[6-8]，但在犬乳腺腫瘤中尚未見到相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討伊維菌素對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，對(duì)細(xì)胞凋亡、自噬水平的影響及可能機(jī)制，為其在獸醫(yī)臨床腫瘤中的研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)公司。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CMT 7364(本實(shí)驗(yàn)室保存)，CIPp(日本東京大學(xué)饋贈(zèng))。

1.1.2 藥物與試劑 伊維菌素，購自Sigma公司；胎牛血清、胰酶、DMEM培養(yǎng)基，均購自美國(guó)Gibco公司；CCK8試劑盒，購自日本東仁公司；annexinV-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)試劑盒，購自BD公司；pEGFP-LC3質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所夏咸柱院士實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)；轉(zhuǎn)染試劑Lipo3000，購自Invitrogen公司；Anti-β-Tubulin antibody，購自Sigma公司；Anti-LC3B antibody、羊抗兔IgG/HRP及羊抗小鼠IgG/HRP，均購自Proteintech公司。

圖3 伊維菌素與犬乳腺腫瘤細(xì)胞自噬的關(guān)系
Fig.3 The effect of ivermectin on autophagy in canine mammary tumor cells
A：熒光顯微鏡下pEGFP-LC3蛋白表達(dá)(標(biāo)尺=50 μm)； B：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞內(nèi)pEGFP-LC3綠色熒光顆粒數(shù)
A: The expression of pEGFP-LC3 by fluorescence microscope (Scale bar = 50 μm); B: The amounts of autophagosomes per cell

1.1.3 儀器 Elx酶標(biāo)儀(Bio Tek)，流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson Bioscience)，熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，雙人面垂直工作臺(tái)(蘇州凈化)，電泳儀(BIO-RAD)，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tannon)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) CMT 7364和CIPp細(xì)胞系接種于含10%胎牛血清和100單位/mL的青霉素鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖率 將CMT 7364和CIPp細(xì)胞系按照1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板，恒溫培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后，分別加入100 μL終濃度為4、8、12、20 μmol/L和 40 μmol/L的伊維菌素，陰性對(duì)照為1% DMSO(Control)，陽性對(duì)照為10 μg/mL順鉑(Cisplain)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，于12、24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育1 h，450 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖率和IC50。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平 將CMT 7364和CIPp細(xì)胞系按照1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后，加入終濃度為12 μmol/L的伊維菌素，處理24 h和48 h后收集所有細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，PBS洗2次，參照annexinV-FITC/PI 雙染試劑盒說明書進(jìn)行染色，200目細(xì)胞篩過濾，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.4 熒光顯微鏡下細(xì)胞自噬的觀察 將CMT 7364和CIPp細(xì)胞系按照1×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，待細(xì)胞融合至80%時(shí)，應(yīng)用Lipo3000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-LC3，12 h后加入終濃度為4 μmol/L和8 μmol/L 的伊維菌素，處理24 h，于顯微鏡下觀察并采集圖像，計(jì)算5個(gè)視野下細(xì)胞漿內(nèi)自噬顆粒的數(shù)目，計(jì)算單個(gè)細(xì)胞內(nèi)自噬顆粒數(shù)。

1.2.5 Western Blot 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 將CMT 7364和CIPp細(xì)胞系按照2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜后，加入終濃度為8 μmol/L和12 μmol/L的伊維菌素，處理24 h和48 h后，收集細(xì)胞，用含1% PMSF 的 RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃,12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA測(cè)定蛋白濃度。按每孔20 μg上樣，12% SDS -PAGE電泳后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉1 h。4 ℃孵育一抗LC3B(1∶2 000)、β-Tublin(1∶2 000)過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)1 h，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色后Tannon凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 伊維菌素抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖 用不同濃度伊維菌素處理犬乳腺腫瘤細(xì)胞12、24 h和48 h后，細(xì)胞的增殖率如圖1所示，隨著藥物濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖率逐漸下降，除最低劑量4 μmol/L外，2種細(xì)胞在伊維菌素處理后的增殖率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。CMT 7364在12、24 h和48 h的IC50分別為12.74、10.20 μmol/L和6.90 μmol/L，CIPp在12、24 h和48 h的IC50分別為15.65、10.76 μmol/L和8.38 μmol/L。

圖1 伊維菌素抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖
Fig.1 Ivermectin inhibits the growth of canine mammary cancer cells*：P<0.05

2.2 伊維菌素對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡水平的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平可發(fā)現(xiàn)，伊維菌素對(duì)細(xì)胞凋亡水平影響輕微(見圖2)。其中CMT 7364細(xì)胞在24 h和48 h凋亡百分比分別為(0.50±0.19)%和(0.79±0.20)%，CIPp細(xì)胞在24 h和48 h凋亡百分比分別為(0.49±0.20)%和(2.34±1.75)%。在伊維菌素處理后的48 h，盡管2種細(xì)胞的凋亡百分比顯著高于對(duì)照組(P值分別為0.000和0.012)(圖2 B)，但細(xì)胞凋亡比例均小于3%。

圖2 伊維菌素與犬乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系
Fig.2 The effect of ivermectin on apoptosis in canine mammary tumor cellsA：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平結(jié)果； B：細(xì)胞凋亡比例統(tǒng)計(jì)結(jié)果 *:P<0.05; **:P<0.01; 下圖同 A: Apoptosis in canine mammary tumor cells by flow cytometry; B: The percentage of apoptosis cells *:P<0.05, **:P<0.01. The same as below

2.3 伊維菌素誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細(xì)胞生成自噬小體 伊維菌素處理24 h后可明顯見到細(xì)胞胞漿內(nèi)pEGFP-LC3綠色熒光顆粒數(shù)目增多，并呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系(見封二彩版圖3 A)。單個(gè)細(xì)胞內(nèi)熒光顆粒數(shù)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)，伊維菌素8 μmol/L處理后細(xì)胞胞漿內(nèi)的自噬顆粒數(shù)目要顯著高于對(duì)照組(P值分別為0.006和0.000)(見封二彩版圖3 B)。

2.4 伊維菌素對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖4所示，隨著伊維菌素濃度的升高和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)可促進(jìn)LC3Ⅰ蛋白向LC3Ⅱ蛋白的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞自噬的發(fā)生。

3 討論

伊維菌素是常用的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，其通過阻斷寄生蟲氯離子通道發(fā)揮作用[9]。近期研究發(fā)現(xiàn)，伊維菌素可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，如抑制WNT-TCF信號(hào)通路、調(diào)節(jié)PAK1以及誘導(dǎo)線粒體功

圖4 伊維菌素對(duì)細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
Fig.4 The effect of ivermectin on autophagy markers in canine mammary tumor cells

能障礙[6-8]。伊維菌素在獸醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用，但在動(dòng)物腫瘤方面尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)首次選擇伊維菌素作為靶向腫瘤藥物進(jìn)行研究，探討其在犬乳腺腫瘤細(xì)胞中的作用及可能機(jī)制。

體外篩選抗腫瘤藥物的第一步即細(xì)胞活性測(cè)定，本研究中選擇CCK-8法檢測(cè)伊維菌素體外對(duì)犬乳腺腫瘤的殺傷作用。結(jié)果顯示，伊維菌素可顯著抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)時(shí)間與劑量依賴性關(guān)系(圖1)。為了進(jìn)一步探究伊維菌素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們進(jìn)行了細(xì)胞凋亡和自噬水平的檢測(cè)。結(jié)果顯示，盡管在伊維菌素處理后細(xì)胞凋亡比例有所上升，但均小于3%(圖2)，說明伊維菌素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制與凋亡關(guān)系不大，黃燦華等[7]的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。然而，在伊維菌素處理后細(xì)胞內(nèi)自噬水平變化很明顯，細(xì)胞漿內(nèi)pEGFP-LC3綠色熒光顆粒數(shù)目明顯增多(中插彩版圖3A)，且與伊維菌素濃度呈正相關(guān)，提示伊維菌素誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生了自噬。Western Blot試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，在伊維菌素處理后細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，同時(shí)促進(jìn)LC3Ⅰ蛋白向LC3Ⅱ蛋白的轉(zhuǎn)化(圖4)。自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及腫瘤治療中扮演重要角色[10-11]，而LC3是自噬體標(biāo)記蛋白，LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值的降低是判斷自噬發(fā)生的標(biāo)志[12]。本研究結(jié)果提示，伊維菌素對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞的抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān)。

自噬是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)制，有研究稱自噬在腫瘤形成的早期起抑制作用，在腫瘤形成后促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[10]，但其具體的作用機(jī)制尚存在爭(zhēng)議。在本研究中，伊維菌素通過誘導(dǎo)抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的細(xì)胞自噬發(fā)揮抗腫瘤作用。

4 結(jié)論

伊維菌素通過誘導(dǎo)犬乳腺腫瘤細(xì)胞自噬發(fā)揮抗腫瘤活性，但其確切的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。