抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗的培育及其抗性喪失的防控策略

馮翠蓮 張樹珍

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所甘蔗研究中心 農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點開放實驗室，海口 571101）

甘蔗（Saccharum officinarumL.）屬于單子葉植物禾本科甘蔗屬，是我國最重要的糖料作物。一直以來，蔗糖占食糖總產(chǎn)量的比例都在70%以上，在2018/2019榨季，蔗糖產(chǎn)量則占全國食糖產(chǎn)量88%［1］。甘蔗也是迄今最成功的可再生能源植物，通過發(fā)酵生產(chǎn)出的燃料乙醇占世界燃料乙醇的40%［2］。因此甘蔗產(chǎn)業(yè)對國民經(jīng)濟(jì)具有重要的意義。近年來由于高產(chǎn)、高糖甘蔗品種的大面積使用，但缺乏相應(yīng)的抗蟲品種，甘蔗蟲害日益嚴(yán)重。甘蔗在大田的整個生長發(fā)育期內(nèi)可受到120余種蟲害威脅［3］，其中條螟、大螟等各種螟蟲的危害尤其嚴(yán)重，苗期受害造成枯心，生長期受害造成蟲害節(jié)、蟲害莖，嚴(yán)重影響產(chǎn)量。甘蔗另一類害蟲——同翅目的綿蚜、粉蚧等，雖然直接造成的產(chǎn)量損失并不如螟蟲的嚴(yán)重，但其危害時傳播甘蔗花葉病等多種甘蔗病毒，是甘蔗多種病毒的傳播媒介。因此，其造成的間接損失比直接危害造成的損失更為嚴(yán)重。

到目前為止，對于甘蔗害蟲的防治主要依賴化學(xué)防治，但長期大量施用化學(xué)農(nóng)藥造成一系列的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等嚴(yán)重問題，因此培育抗蟲甘蔗新種質(zhì)是甘蔗育種的一個重要目標(biāo)。然而甘蔗是高度雜合的無性繁殖作物，其遺傳背景十分復(fù)雜，基因組巨大，通常表現(xiàn)為異源多倍體和多倍的非整倍體［4］，給育種工作帶來很大的盲目性；另一方面由于缺乏甘蔗抗蟲種質(zhì)資源，因此要想通過常規(guī)的雜交育種方法和程序在優(yōu)良品種中引入抗源無疑是非常困難的。除此以外，甘蔗有性雜交經(jīng)常遇到開花困難、花期不遇、雜交不孕和不育等問題［5］，最終導(dǎo)致甘蔗的抗蟲育種工作遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其它作物。然而，基因工程可以定向改變作物的某些性狀，在棉花、玉米、大豆等作物上改良其抗蟲性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)越來越廣泛應(yīng)用。在常規(guī)條件下栽培種甘蔗不容易開花，或即便開花也表現(xiàn)為花粉敗育授粉困難，因此由花粉引起的基因漂移的潛在風(fēng)險極小。以及甘蔗原料的工業(yè)制成品不含轉(zhuǎn)基因蛋白，因此轉(zhuǎn)基因甘蔗是轉(zhuǎn)基因風(fēng)險最低、轉(zhuǎn)基因安全等級最高的植物之一［2］。隨著甘蔗組織培養(yǎng)和離體再生等技術(shù)體系日漸成熟，因此利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高甘蔗抗蟲性將是甘蔗抗蟲育種的重要新途徑。

1 轉(zhuǎn)基因甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化體系的發(fā)展及遺傳穩(wěn)定性的研究

轉(zhuǎn)基因甘蔗的研究始于20世紀(jì)90年代初，經(jīng)過30年的努力，取得了很大的成果。以胚性愈傷組織為受體細(xì)胞，以基因槍或農(nóng)桿菌介導(dǎo)為轉(zhuǎn)化方法的轉(zhuǎn)化體系，以及以抗生素、除草劑為篩選劑的篩選方法已經(jīng)比較成熟。但仍然存在轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)基因沉默等問題，不足以支持轉(zhuǎn)基因甘蔗的規(guī)模化生產(chǎn)，因此國內(nèi)外相關(guān)研究者對建立高效廣譜穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選的研究依然進(jìn)行中。

1.1 轉(zhuǎn)基因甘蔗的轉(zhuǎn)化

轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化是遺傳轉(zhuǎn)化的主體部分，是轉(zhuǎn)基因是否成功的關(guān)鍵，包括轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞的選擇、轉(zhuǎn)化方法等。縱觀目前已發(fā)表的甘蔗轉(zhuǎn)基因相關(guān)論文，轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞最有效的依然是胚性愈傷細(xì)胞。針對轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，Manickavasagam等［6］曾嘗試使用腋芽，以農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法轉(zhuǎn)化，獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗存在嵌合體嚴(yán)重的問題，實驗結(jié)果不理想，再一次證實當(dāng)前最理想的轉(zhuǎn)化受體是胚性愈傷細(xì)胞。

目前，轉(zhuǎn)基因甘蔗主要的轉(zhuǎn)化方法包括基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化的最早報道在1992年，Bower和Birch 就是利用基因槍法把Npt-II和B-Glucuronidase基因?qū)敫收嶂校肎eneticin（G418）和GUS染色篩選得到第一批轉(zhuǎn)基因甘蔗［7-8］。之后利用該法相繼獲得了抗蟲、抗除草劑、抗病、抗旱等轉(zhuǎn)基因甘蔗和作為生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因甘蔗。但基因槍法存在成本高、遺傳轉(zhuǎn)化效率低、拷貝數(shù)高，轉(zhuǎn)化植株的穩(wěn)定性差等因素的限制，阻礙其在甘蔗轉(zhuǎn)基因中的廣泛應(yīng)用。而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有成本低、成功率高、導(dǎo)入的外源基因多為單拷貝，遺傳穩(wěn)定性好的優(yōu)點，更有利于轉(zhuǎn)基因材料的生產(chǎn)化應(yīng)用，因此農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法在甘蔗轉(zhuǎn)基因應(yīng)用中迅速發(fā)展。

1998 年 Arencibia等［9］和 Elliott等［10］分別把Hpt和Gfp基因成功導(dǎo)入甘蔗中，通過潮霉素篩選和熒光檢測篩選，首次建立了甘蔗農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。同年 Enríquez-Obregón 等［11］利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把bar基因?qū)敫收嶂校褂貌莅缝⒊輨┖Y選獲得首例抗除草劑轉(zhuǎn)基因甘蔗。2007年，Zhangsun等［12］系 統(tǒng) 地 比 較 了 甘 蔗 品 種（FN81-745和Badila）、農(nóng)桿菌菌株（LBA4404，EHA105和A281）及其最適濃度、篩選劑（hpt II/Hyg），bar/PPT和npt II/G418）、培養(yǎng)基成分、植物組織共培養(yǎng)的方法等因素對根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化效率的影響，并對以上因素進(jìn)行了優(yōu)化，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)化的有效方案。然而以上方案的轉(zhuǎn)化效率仍然比較低，不足以滿足轉(zhuǎn)基因甘蔗大規(guī)模商業(yè)化的需求。為了實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因甘蔗商業(yè)化的需求，先正達(dá)公司投入大量的人力和物力，于2010年前后開始與世界上掌握農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘蔗技術(shù)的幾個實驗室合作，共同研發(fā)高效廣譜穩(wěn)定的甘蔗農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系，本研究室有幸成為合作者之一。據(jù)2014年先正達(dá)公司的研發(fā)人員Dong等［13］報道，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后共培養(yǎng)階段進(jìn)行干燥處理是高效轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，該法對甘蔗品種Q117 和L97-128 的轉(zhuǎn)化效率均可達(dá)到每克侵染愈傷獲得20個株系，現(xiàn)已在兩個不同的實驗室中由超過6名研究人員在CP72-1210、Q208、KQ228、SP70-1143、CP89-2143、L99-226、L99-233 和 CP84-1198八個以上的甘蔗品種中得到驗證，是迄今為止報道的最穩(wěn)定的甘蔗轉(zhuǎn)化體系，并證實了外源基因在各個轉(zhuǎn)基因甘蔗品種及其多個生長季節(jié)中的穩(wěn)定表達(dá)。證明了該轉(zhuǎn)化技術(shù)可以滿足轉(zhuǎn)基因甘蔗大規(guī)模商業(yè)化的需求。

1.2 轉(zhuǎn)基因甘蔗的篩選

轉(zhuǎn)基因篩選是遺傳轉(zhuǎn)化的重要部分，是能否成功從大量的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中選擇并有效增值轉(zhuǎn)化細(xì)胞的關(guān)鍵。用于轉(zhuǎn)基因甘蔗的篩選基因可以分為兩大類，一是包括抗生素和抗除草劑在內(nèi)的抗性基因；二是磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因（pmi）等對生物安全的非抗性標(biāo)記基因。

抗生素是轉(zhuǎn)基因甘蔗篩選最早使用的篩選劑，主要有Kan/卡那霉素、Npt-II/新霉素（G418），Hpt II/潮霉素等，抗生素篩選普遍存在篩選率低，假陽性高的缺點，如經(jīng)Hpt/潮霉素篩選的轉(zhuǎn)化事情的轉(zhuǎn)化率僅為0.63%，Npt II/G418篩選的轉(zhuǎn)化率為1.38%［14］。另一方面隨著公眾對轉(zhuǎn)基因作物安全性問題的越來越關(guān)注。使用抗生素作為篩選劑已經(jīng)慢慢被淘汰。

除草劑既能用于篩選轉(zhuǎn)基因甘蔗細(xì)胞，同時又賦予了轉(zhuǎn)基因甘蔗抗除草劑的特性，因此除草劑作為轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選劑的應(yīng)用更為廣泛。編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Phosphinthricin acetyltransferase，PAT）的bar基因是最早最普遍應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因甘蔗篩選的抗除草劑基因，但仍然存在轉(zhuǎn)化率低的問題，如2015年Zhang等［14］報道經(jīng)bar/PPT篩選后的轉(zhuǎn)化率僅為0.47%［14］（轉(zhuǎn)化率低的原因跟轉(zhuǎn)化方法也有關(guān)系）。本實驗室自2000年以來一直致力于研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化甘蔗，通過對甘蔗胚性愈傷組織誘導(dǎo)、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件及轉(zhuǎn)化體篩選等過程的優(yōu)化，經(jīng)bar/basta篩選后轉(zhuǎn)化效率和篩選效率得到了極顯著的提高，分別提高到20%和90%［15-16］。然而草胺膦、basta等除草劑由于使用成本高，因此未廣泛使用；而另一種廣泛使用的草甘膦，由于近10多年來，大量抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物品種的推廣和種植，導(dǎo)致抗草甘膦雜草的產(chǎn)生，基于以上兩原因，人們開始尋找不同類型的抗除草劑基因作為轉(zhuǎn)基因甘蔗的篩選基因。乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）抑制劑除草劑是抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物品種大量種植之前主要使用的除草劑。近年來在多種雜草及作物上發(fā)現(xiàn)突變的ALS基因會產(chǎn)生抗除草劑的性能，因而突變的mALS基因作為篩選基因成為人們的首選。2013年，Vyver等［17］第一個利用植物來源的抗磺酰脲除草劑的突變mALS基因應(yīng)用于甘蔗轉(zhuǎn)化細(xì)胞，首次建立來源于煙草的突變乙酰乳酸合酶基因（mALS）/氯磺隆除草劑篩選技術(shù)，利用基因槍轟擊法，篩選率為75%，逃逸率25%，但篩選效率比nptII/G418篩選效率低；而Dermawan等［18］則于2016年利用來源于高粱的mALS基因，同樣使用基因槍轉(zhuǎn)化法，建立了高粱突變乙酰乳酸合酶基因/雙草醚除草劑篩選技術(shù)，此篩選效率與nptII/geneticin篩選效率相當(dāng)，但比煙草mALS基因/氯磺隆除草劑的篩選效率高，文中作者推測可能是高粱跟甘蔗的親緣關(guān)系比煙草跟甘蔗的更接近的緣故。此類轉(zhuǎn)基因甘蔗可抗氯磺隆、甲磺隆、氯嘧磺隆、雙草醚等磺酰脲類除草劑。

隨著轉(zhuǎn)基因作物的商品化，抗性篩選基因潛在的生態(tài)和食用安全性越來越受關(guān)注。因此研究者不斷尋找比除草劑更為安全有效的篩選標(biāo)記基因。如正向選擇篩選劑甘露糖pmi/mannose。2007年，Jain等［19］通過基因槍轟擊法，首次在甘蔗轉(zhuǎn)化細(xì)胞篩選中應(yīng)用了pmi/mannose，獲得的轉(zhuǎn)化效率為7.4%。2015年，Zhang等［14］，同樣利用基因槍轟擊法，系統(tǒng)的比較了常用的幾種篩選方法的轉(zhuǎn)化率，經(jīng)PCR和CPR檢測，pmi/mannose篩選的轉(zhuǎn)化率為4.2%，bar/PPT的轉(zhuǎn)化率為0.47%，npt II/G418的轉(zhuǎn)化率為1.38%，而hpt/Hygromycin的轉(zhuǎn)化率為0.63%，由此可見pmi/mannose篩選的轉(zhuǎn)化率是最高的。上述報道的pmi/mannose的轉(zhuǎn)化率較低，很大原因在于基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化效率低。2015年，本研究團(tuán)隊王文治等［20］應(yīng)用本室成熟的農(nóng)桿菌介導(dǎo)甘蔗轉(zhuǎn)基因技術(shù)，成功建立了高效的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗轉(zhuǎn)基因甘露糖篩選技術(shù)，單次轉(zhuǎn)化4 g愈傷組織可以獲得30個以上的轉(zhuǎn)基因株系，pmi/mannose的篩選陽性效率達(dá)到87%，該技術(shù)具有轉(zhuǎn)化效率高、轉(zhuǎn)化基因型廣、轉(zhuǎn)化體穩(wěn)定性好并可實現(xiàn)多基因同時轉(zhuǎn)化等特點。

1.3 轉(zhuǎn)基因甘蔗遺傳穩(wěn)定性的研究

轉(zhuǎn)基因的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性是轉(zhuǎn)基因甘蔗的成功商業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵因素。T-DNA插入序列的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)基因表達(dá)一致性在轉(zhuǎn)基因甘蔗中尤為重要，因為甘蔗種植涉及宿根和新植等無性營養(yǎng)繁殖。然而，關(guān)于無性營養(yǎng)繁殖植物中的轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性研究的報道并不多。轉(zhuǎn)基因甘蔗存在轉(zhuǎn)基因沉默或其他會影響轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性的遺傳重排的可能性。據(jù)早期的報道，在甘蔗T0中存在轉(zhuǎn)基因沉默，轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，發(fā)育調(diào)節(jié)和轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后機(jī)制都有可能影響轉(zhuǎn)基因穩(wěn)定性［21-24］；而2014年有報道表明在第一代宿根甘蔗中，GUS、纖維二糖水解酶I、纖維二糖水解酶II和細(xì)菌內(nèi)切葡聚糖酶的轉(zhuǎn)基因表達(dá)活性有所提高［25-26］。此外，Joyce等［27］報道了新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPTII）蛋白質(zhì)在第一代和第二代宿根甘蔗中則可以穩(wěn)定地積累。關(guān)于不同繁殖方法和連續(xù)宿根多年的轉(zhuǎn)基因甘蔗的外源基因表達(dá)一致性的綜合研究更是寥寥無幾，先正達(dá)公司為推進(jìn)轉(zhuǎn)基因甘蔗的商品化生產(chǎn)，對多個轉(zhuǎn)基因甘蔗的外源基因的遺傳穩(wěn)定性及表達(dá)一致性進(jìn)行了為期4年的深入研究。據(jù)其研發(fā)人員Caffall等［28］報道，以在美國和巴西廣泛種植的3個甘蔗商業(yè)品種L97-128、CP84-1198和SP70-1143為受體，經(jīng)過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法得到17個轉(zhuǎn)基因事件，于2009-2013年間，系統(tǒng)的監(jiān)測了這些植株的外源基因PMI或熒光蛋白基因AmCYAN1在田間連續(xù)宿根四代和新植無性繁殖后代的甘蔗基因組中的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)基因表達(dá)一致性。結(jié)果顯示包括外源基因在內(nèi)的整個T-DNA插入序列可在各世代中穩(wěn)定遺傳，沒有觀察到轉(zhuǎn)基因重排或丟失；AmCYAN1和PMI在各世代中并沒有發(fā)生轉(zhuǎn)基因沉默，蛋白表達(dá)水平一致。這些結(jié)果為轉(zhuǎn)基因甘蔗成功商業(yè)化提供了理論依據(jù)。

1.4 轉(zhuǎn)基因甘蔗安全性評價

轉(zhuǎn)基因甘蔗的安全性評價是關(guān)系到轉(zhuǎn)基因甘蔗能否順利推廣應(yīng)用的關(guān)鍵所在。由于甘蔗無性繁殖的特性，甘蔗開花困難、自然條件下授粉困難，以及甘蔗原料的工業(yè)制成品不含轉(zhuǎn)基因蛋白，因此轉(zhuǎn)基因甘蔗是轉(zhuǎn)基因安全等級較高的植物。轉(zhuǎn)基因甘蔗安全性評價總體要求跟其他作物一致。轉(zhuǎn)基因甘蔗經(jīng)過研究實驗、中間試驗、環(huán)境釋放和生產(chǎn)性試驗等試驗程序，并取得安全證書才算是被國家認(rèn)定為安全的具備商業(yè)化可能性的對象。但國家認(rèn)定為安全并不意味著可以商業(yè)化種植，還要經(jīng)過品種登記程序才具備商業(yè)化推廣的資格。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織（ISAAA）截至2020年2月在其網(wǎng)站發(fā)布的數(shù)據(jù)，獲得安全證書的甘蔗轉(zhuǎn)基因事件共有6例［29］:（1）2017年巴西國家生物安全技術(shù)委員會批準(zhǔn)了BT（Cry1Ab）抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗CTB141175/01-A在巴西的商業(yè)化應(yīng)用，包括用于食品、飼料和種植或釋放到環(huán)境中，它是巴西甘蔗技術(shù)中心（Centro de Tecnologia Canavieira，CTC）的研發(fā)產(chǎn)品。據(jù)報道，該轉(zhuǎn)基因甘蔗于2018年開始在巴西種植，面積約為400 hm2，這是世界上第一個商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因甘蔗品種［30］，同時該品種于2018年在加拿大、美國獲得用于食品的安全證書。（2）巴西甘蔗技術(shù)中心研發(fā)的另一個BT（Cry1Ac）抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗CTC91087-6和CTC93209-4兩個株系于2018年獲得巴西國家生物安全技術(shù)委員會的批準(zhǔn)，可在巴西商業(yè)化應(yīng)用，包括用于食品、飼料和種植或釋放到環(huán)境中。（3）轉(zhuǎn)入來源于大腸桿菌的膽堿脫氫酶基因（EcBetA）耐旱轉(zhuǎn)基因甘蔗的NXI-1T，于2011年獲得印度尼西亞生物安全委員會的用于食品和種植或釋放到環(huán)境的安全證書；（4）其余兩例是轉(zhuǎn)入來源于苜蓿根瘤菌的膽堿脫氫酶基因（RmBetA）耐旱轉(zhuǎn)基因甘蔗的NXI-4T、NXI-6T兩個株系，于2013年獲得印度尼西亞生物安全委員會的用于食品和種植或釋放到環(huán)境的安全證書，其中NXI-4T品種于2018年獲得用于飼料的安全證書，至此該株系完成了所有安全評估，商品化應(yīng)用指日可待。由此可見，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)和安全評價體系的不斷完善與發(fā)展，尤其基因編輯新技術(shù)的應(yīng)用，轉(zhuǎn)基因甘蔗商品化應(yīng)用將越來越廣泛。

2 抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗研究進(jìn)展

2.1 國內(nèi)外抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗研究現(xiàn)狀

抗蟲轉(zhuǎn)基因是甘蔗各類轉(zhuǎn)基因研究中最成功的領(lǐng)域。迄今為止，美國、澳大利亞、巴西、南非、古巴、泰國、印度、新加坡、中國等都先后開展了甘蔗抗蟲轉(zhuǎn)基因研究。由于Bt基因表達(dá)的毒蛋白可特異性地毒殺鱗翅目、同翅目、鞘翅目和雙翅目等害蟲，卻對人畜無害，因此在甘蔗抗蟲轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用最廣。自1994年首次應(yīng)用Cry1Ac基因轉(zhuǎn)化甘蔗獲得抗螟蟲的轉(zhuǎn)基因甘蔗后，Cry1Ab、Cry1Aa3、Cry2A、Cry2Ab及人工改造的Cry1Ac均相繼被轉(zhuǎn)入甘蔗中，于2017年獲得全球首例商業(yè)化種植許可的轉(zhuǎn)基因甘蔗品種正是轉(zhuǎn)入了BT（Cry1Ab）抗蟲基因。除此以外，在甘蔗抗蟲轉(zhuǎn)基因中應(yīng)用的還有雪花蓮凝集素（GNA）及蛋白酶抑制劑（PI）基因、胰蛋白酶抑制劑（SKTI）基因、大豆抑制劑（SBBI）基因、野莧菜凝集素（AVA）基因等。另一方面除了利用單價的抗蟲基因外，利用Bt基因與其他類型的抗蟲基因組合，構(gòu)成雙價和融合抗蟲基因也慢慢發(fā)展起來。到目前為止，具有較好抗蟲性的轉(zhuǎn)基因甘蔗的文獻(xiàn)詳見表1。

2.2 我國抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗研究存在的問題

根據(jù)表1已報到的文獻(xiàn)，國內(nèi)轉(zhuǎn)基因甘蔗的轉(zhuǎn)化方法主要以基因槍轟擊為主，獲得的轉(zhuǎn)基因植株外源基因拷貝數(shù)多，有的受體植株的農(nóng)藝性狀受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因材料難以應(yīng)用于生產(chǎn)。如2016年，高世武等［46］把CrylAc基因轉(zhuǎn)入甘蔗高糖品種FN15，轉(zhuǎn)基因植株的外源基因的拷貝數(shù)1-148不等，毒蛋白在葉中表達(dá)量高、轉(zhuǎn)基因植株的螟蟲受害率低，但CrylAc基因拷貝數(shù)越多、表達(dá)量越高對植株的農(nóng)藝性狀影響越大；另外我國科研人員Weng等［41］通過提高CrylAc基因中GC含量，從37.4%增加至47.5%，并再次提高至54.8%，獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗內(nèi)毒蛋白的表達(dá)量和轉(zhuǎn)基因甘蔗對螟蟲的抗性雖然很高，但經(jīng)過抗蟲性及重要經(jīng)濟(jì)、農(nóng)藝性狀的評價后發(fā)現(xiàn)，除了抗蟲性外，總體而言，經(jīng)濟(jì)性狀都不如原供體品種，很難直接從中選育抗蟲品種用于甘蔗生產(chǎn)。分析其原因推測是所得的轉(zhuǎn)基因甘蔗由基因槍轟擊而獲得的，CrylAc基因的拷貝數(shù)多（4-11），毒蛋白大量在甘蔗體內(nèi)積累而影響了甘蔗正常的生長發(fā)育。由此可見，由基因槍轟擊獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗普遍存在外源基因拷貝數(shù)多的問題，基因槍轟擊法難以控制外源基因插入的拷貝數(shù)，因此具有外源基因插入拷貝數(shù)少的優(yōu)點的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法則更適合用于轉(zhuǎn)基因甘蔗。

表1 抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗

然而目前國內(nèi)只有少數(shù)科研團(tuán)隊掌握根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘蔗的技術(shù)。本研究團(tuán)隊自20世紀(jì)90年代末起，一直致力于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甘蔗的研究，經(jīng)過近20年的努力，取得了一些進(jìn)展。目前通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，已獲得外源基因的拷貝數(shù)為1-3個低拷貝的多個轉(zhuǎn)基因株系，并通過初步抗蟲性測定和農(nóng)藝性狀測定，從中篩選出數(shù)個具有較好抗蟲效果和農(nóng)藝性狀未受影響的轉(zhuǎn)基因株系，目前正在對所獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗無性系后代進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性評價和農(nóng)藝性狀的進(jìn)一步鑒定。此項工作有望解決由于外源基因拷貝數(shù)多而影響甘蔗產(chǎn)量的問題。

此外，從表1還可以發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因甘蔗的抗蟲基因單一，抗蟲效果有效的基因仍然以Bt為主。現(xiàn)急需發(fā)掘更多有效的Bt基因及其他抗蟲基因資源。

3 延緩和防止轉(zhuǎn)基因甘蔗抗蟲性喪失的策略

當(dāng)抗蟲轉(zhuǎn)基因作物大規(guī)模的商業(yè)化種植后，靶標(biāo)害蟲種群長期處于較高的選擇壓力下，最終導(dǎo)致靶標(biāo)害蟲對轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性，害蟲一旦產(chǎn)生抗性，轉(zhuǎn)基因作物的抗性則喪失［65］。隨著轉(zhuǎn)Bt基因作物商業(yè)化種植的時間推移，害蟲對轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生抗性的問題逐漸暴露出來。據(jù)報道自然條件下轉(zhuǎn)基因作物連續(xù)種植6年后，棉鈴蟲將對Bt作物產(chǎn)生抗性。目前田間已發(fā)現(xiàn)的對Bt作物產(chǎn)生抗性的昆蟲除了棉鈴蟲外還有草地貪夜蛾、棉紅鈴蟲、玉米根螢葉甲和玉米莖蛀褐夜蛾等，涉及的Bt基因有cry1Ab、cry1Ac、cry1F和cry3Bb［66］，每一個抗蟲轉(zhuǎn)基因作物在商業(yè)化生產(chǎn)前都需要投入大量資金進(jìn)行研發(fā)，但當(dāng)靶標(biāo)害蟲通過適應(yīng)和變異獲得抗性進(jìn)化后，對轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性，該轉(zhuǎn)基因作物將可能毀于一旦，喪失了原有商品價值。因此靶標(biāo)害蟲的抗性進(jìn)化是抗蟲轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化生產(chǎn)的最大威脅，延緩和防止轉(zhuǎn)基因甘蔗抗蟲性的喪失已成為抗蟲轉(zhuǎn)基因的一個不可忽視的研究內(nèi)容。綜合當(dāng)前國內(nèi)外的研究，延緩和防止抗蟲轉(zhuǎn)基因作物喪失抗蟲性的主要有效策略有“高劑量-庇護(hù)所”（HDR）的治理策略和多個抗蟲基因聚合策略。

3.1 “高劑量-庇護(hù)所”策略

針對害蟲對Bt蛋白產(chǎn)生抗性，Bt作物喪失抗蟲性的問題，美國和加拿大政府提出了抗性治理“高劑量/庇護(hù)所”策略，它是根據(jù)昆蟲生態(tài)學(xué)和種群遺傳學(xué)等理論，經(jīng)過計算機(jī)模擬研究結(jié)果而提出的，是目前國內(nèi)外最為廣泛應(yīng)用的延緩和防止Bt作物喪失抗蟲性的治理策略［67-68］。

高劑量是指轉(zhuǎn)Bt基因作物表達(dá)足以殺死所有敏感品系和抗性品系的雜合子靶標(biāo)害蟲的殺蟲蛋白。由于Bt基因來源于蘇云金芽孢桿菌，存在在植物中表達(dá)量極低的問題。有專家曾對原始的Bt基因進(jìn)行植物偏愛性的密碼子優(yōu)化，以期提高Bt基因在轉(zhuǎn)基因作物中的表達(dá)量，改造措施包括消除AT富集區(qū)、增加GC含量、添加引導(dǎo)序列和加尾識別信號等［69］。其中我國甘蔗研究專家Weng等［40-41］將CrylAc基因中GC含量從37.4%增加至47.5%，由Ubi啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)化甘蔗，獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗組織內(nèi)毒蛋白的量是Arencibia等報道的7倍多；2011年該作者通過進(jìn)一步改造CrylAc基因，再次將GC含量提高至54.8%，獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗的毒蛋白表達(dá)量達(dá)到每毫克可溶性蛋白含2.2-50.0 ng，該甘蔗對螟蟲的抗性提高了5倍。2012年，陳勇生等［42］對上述的其中6個轉(zhuǎn)Bt基因甘蔗品系進(jìn)行了抗蟲性評價，結(jié)果顯示不同的轉(zhuǎn)基因甘蔗品系均表現(xiàn)出良好的抗（螟）蟲性，表現(xiàn)最好的兩個株系的螟害株率和螟害節(jié)率比相應(yīng)的對照品種降低100%，螟害株率和螟害節(jié)率均為零。

庇護(hù)所是在抗蟲轉(zhuǎn)基因作物的附近種植一定比例的非轉(zhuǎn)基因作物，從而為敏感種群提供庇護(hù)所，該種群可與已對Bt作物產(chǎn)生抗性的種群進(jìn)行隨機(jī)交配，防止抗性純合個體的產(chǎn)生，從而稀釋抗性基因，延緩害蟲抗性的產(chǎn)生，防止Bt作物抗性的喪失［67］。如在美國，環(huán)保局規(guī)定需要保留4%的面積種植不使用任何化學(xué)殺蟲劑的非Bt轉(zhuǎn)基因作物，或保留20%-30%的面積種植可使用化學(xué)殺蟲劑的非Bt轉(zhuǎn)基因作物［70］，在這種嚴(yán)格采取“高劑量-庇護(hù)所”策略的地區(qū)里，到目前為止尚未有大規(guī)模顯著的靶標(biāo)害蟲產(chǎn)生抗性的報道。在我國，以小農(nóng)種植模式為主，轉(zhuǎn)基因棉花多與其他作物（如玉米、大豆和小麥）連片種植，而棉鈴蟲的寄主除了棉花，還有小麥、玉米、大豆、谷子等多種作物，這些作物可作為天然庇護(hù)所，因此可有效控制靶標(biāo)害蟲的抗性發(fā)展，防止Bt作物抗蟲性的喪失［71］。

3.2 多基因聚合策略

基因聚合是將兩種或兩種以上作用方式不同的抗蟲基因或者其他抗蟲基因同時轉(zhuǎn)入同一種作物，形成雙價或多價抗蟲作物，此策略不僅能有效地增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲性，還可以拓寬抗蟲作物的殺蟲譜，是延緩轉(zhuǎn)基因作物抗蟲性下降甚至喪失的有效途徑，該策略在美國已被廣泛采用。

多基因聚合策略要考慮每個單獨基因都有極強(qiáng)的作用和聚合后交叉抗性幾率低的兩個基本原則，這樣，靶標(biāo)害蟲同時對兩種不同抗蟲蛋白產(chǎn)生抗性的幾率就會大大降低。據(jù)報道，Cry1Ac和Cry2Ab的聚合是現(xiàn)在應(yīng)用最廣泛、效果也很好的聚合策略［72］，因為兩者的氨基酸同源性低且在昆蟲中腸的作用位點不同，從而使昆蟲對它們產(chǎn)生交叉抗性的概率很低。此外，Cry1A類蛋白和 Cry1C、Cry9C、Cry1Ie在昆蟲腸道的結(jié)合位點也是不同的，因此cry1Ab/c和cry1C、cry1Ab/c和cry1Ie也是具有潛在價值的基因組合［73］。另外，還有報道cry34Ab和cry35Ab是對西方玉米根蟲非常有效的雙價聚合基因［74］。

多基因聚合在玉米、棉花等作物上應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛。轉(zhuǎn)基因作物種植大國如美國、澳大利亞、印度等種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉已經(jīng)由單價抗蟲棉逐漸過渡到雙價甚至多價的抗蟲棉。2010年在美國和加拿大上市的SmartstaxTM轉(zhuǎn)基因玉米（孟山都公司和陶氏公司研發(fā)）利用已獲得的MON89034、TC1507、MON88017和DAS-59122-7 4個轉(zhuǎn)基因玉米，按常規(guī)雜交的方法將6個抗蟲基因（cry1A.105、cry1Ab、cry2Ab、cry1Fa四個抗鱗翅目昆蟲基因和cry34Ab、cry35Ab兩個抗根部害蟲基因）和兩個抗除草劑基因（pat和epsps/cp4）聚合到一起，育成抗多種害蟲及抗除草劑的SmartStaxTM新品種，任何一種靶標(biāo)害蟲都很難在短期內(nèi)對其產(chǎn)生抗性，從而實現(xiàn)了對多種昆蟲和除草劑的抗性，該品種具有極高的商品應(yīng)用價值［75］。而在抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗方面，2018年巴西孟山都公司把Cry2Ab、Cry1Ab、EPSPS-CP4構(gòu)建于一個表達(dá)盒中，通過一次轉(zhuǎn)化完成3個基因的聚合，獲得的轉(zhuǎn)基因甘蔗在田間試驗中表現(xiàn)了很好地螟抗性和草甘膦耐受性，并通過模擬實驗證明:若保持甘蔗螟蟲100代內(nèi)不產(chǎn)生抗性，雙價抗蟲基因甘蔗比相應(yīng)的單價抗蟲甘蔗需要更小的避難所和具有更大的抗蟲耐久性，也就說多抗蟲基因更能延遲害蟲抗性的演變，保持更持久的抗蟲性［76］。

國內(nèi)，在多基因抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗方面也做了一些研究:鄧智年［77］利用六氨基酸的柔性多肽把殺蟲基因AVAc和CpT1融合轉(zhuǎn)化甘蔗，吳轉(zhuǎn)娣等［78］把Bt和sck雙價抗蟲基因?qū)敫收帷１狙芯繄F(tuán)隊的成員王文治［53］把具有4個獨立閱讀框的bar、Cry1Ab等以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入甘蔗中，并證實了4個基因可以在少數(shù)的轉(zhuǎn)基因甘蔗的T1和T2無性繁殖后代中穩(wěn)定遺傳，并有效表達(dá)。但4個基因均使用同一個啟動子和終止子，即連鎖基因轉(zhuǎn)化，由于相同啟動子終止子間的干擾，隨著轉(zhuǎn)基因甘蔗的生長發(fā)育，引起基因沉默可能較大。針對連鎖基因轉(zhuǎn)化法的缺點，本文作者利用具有自我剪切功能的連接多肽FMDV 2A序列將CryIAc和gna兩個不同抗蟲機(jī)制的基因融合后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化甘蔗，實現(xiàn)兩個蛋白在甘蔗體內(nèi)的同步表達(dá)并獨立行使各自功能的目標(biāo)，從而培育抗螟蟲綿蚜以及蠐螬等多種害蟲，并具有持久抗蟲性的甘蔗新品種。已得到的轉(zhuǎn)基因甘蔗到目前已經(jīng)無性繁殖了6個世代，其抗蟲穩(wěn)定性仍然保持良好［79-80］。目前轉(zhuǎn)基因甘蔗的安全評價后續(xù)工作正在進(jìn)行中。

4 影響我國抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗產(chǎn)業(yè)化的主要問題和建議

經(jīng)過20多年的努力，近兩年甘蔗轉(zhuǎn)基因研究已取得長足的進(jìn)展，尤其是抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗研制方面，2018年，巴西已經(jīng)有兩例抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗投入商品化生產(chǎn)。然而，由于國內(nèi)有關(guān)轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)薄弱、安全性方面的爭論、政策的不確定性，致使我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程進(jìn)展緩漫，與發(fā)達(dá)國家相比依然有明顯的差距，主要表現(xiàn)在以下幾個方面。

4.1 轉(zhuǎn)基因基礎(chǔ)研究還有待于加強(qiáng)

我國抗蟲轉(zhuǎn)基因甘蔗的基礎(chǔ)研究還是相對薄弱:首先甘蔗遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系還需加大研發(fā)力度，通過優(yōu)化愈傷、誘導(dǎo)與分化等重要環(huán)節(jié)的質(zhì)量和效率，不斷完善已有的轉(zhuǎn)化方法，開發(fā)轉(zhuǎn)基因新技術(shù)、新方法，解決轉(zhuǎn)化效率低、受體基因型依賴性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化周期長等問題，實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化、工廠化和流水線式的高效廣譜甘蔗轉(zhuǎn)化技術(shù)體系；其次轉(zhuǎn)基因甘蔗的多抗蟲性狀還有待加強(qiáng)，通過構(gòu)建大容量多元表達(dá)載體及多基因轉(zhuǎn)化技術(shù)，導(dǎo)入多抗蟲聚合基因培育多抗性高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)安全的轉(zhuǎn)基因甘蔗；最后轉(zhuǎn)基因甘蔗的安全性尚需提升，通過選擇更安全標(biāo)記基因、甚至無選擇標(biāo)記、或采用雙T-DNA載體結(jié)構(gòu)等多項技術(shù)，全面提升轉(zhuǎn)基因甘蔗的安全性。最終實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因甘蔗的高效、安全和規(guī)模化是甘蔗轉(zhuǎn)基因研究的發(fā)展趨勢。

4.2 缺乏具有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因甘蔗技術(shù)體系

由于甘蔗是無性繁殖作物，目前國內(nèi)尚未建立起現(xiàn)代甘蔗種業(yè)，且但從外觀上看無法分辨轉(zhuǎn)基因甘蔗與傳統(tǒng)品種的差別，因此轉(zhuǎn)基因甘蔗商業(yè)化后必然會遇到品種的假亂雜現(xiàn)象，而中國小規(guī)模農(nóng)戶種植形式和傳統(tǒng)物權(quán)法中“一物一權(quán)”觀念將無法理清轉(zhuǎn)基因甘蔗所涉及的知識產(chǎn)權(quán)問題。因此，中國在批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因甘蔗商業(yè)化種植前必須先明確其產(chǎn)權(quán)問題，推進(jìn)轉(zhuǎn)基因甘蔗的技術(shù)成果轉(zhuǎn)化水平，保障轉(zhuǎn)基因甘蔗基因資源的完整性，為中國轉(zhuǎn)基因甘蔗產(chǎn)業(yè)的戰(zhàn)略發(fā)展提供必要的保障。

4.3 缺乏完整的轉(zhuǎn)基因甘蔗安全管理體系

構(gòu)建轉(zhuǎn)基因甘蔗的安全管理體系對轉(zhuǎn)基因甘蔗的商業(yè)化應(yīng)用最為重要，針對轉(zhuǎn)基因甘蔗而言，其中最關(guān)鍵的就是轉(zhuǎn)基因甘蔗信息數(shù)據(jù)庫的建立。完整的轉(zhuǎn)基因甘蔗信息數(shù)據(jù)庫能夠保障對轉(zhuǎn)基因甘蔗從生產(chǎn)源頭到消費終端之間的各個環(huán)節(jié)的全面追蹤溯源，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因甘蔗在產(chǎn)業(yè)化過程中可控制性和可監(jiān)督性，同時也能夠確保相關(guān)法律法規(guī)、產(chǎn)權(quán)信息和市場信息的公開化。根據(jù)葉頡等［2］發(fā)表的論文，轉(zhuǎn)基因甘蔗信息數(shù)據(jù)庫應(yīng)收錄以下4個方面的信息:轉(zhuǎn)基因甘蔗生物學(xué)特性等相關(guān)信息、轉(zhuǎn)基因甘蔗環(huán)境安全評價信息、轉(zhuǎn)基因甘蔗品種的分子特征、支撐上述有關(guān)信息的參考文獻(xiàn)等。

4.4 轉(zhuǎn)基因甘蔗政策法規(guī)體系還有待于進(jìn)一步優(yōu)化

轉(zhuǎn)基因甘蔗的開發(fā)利用周期長，政策風(fēng)險高，對于政策法規(guī)有著超強(qiáng)的依存性。目前，盡管中國在《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》中規(guī)定了轉(zhuǎn)基因生物的安全風(fēng)險等級，然而各種生物的生物學(xué)特性的差異、生長、繁殖或種植、生產(chǎn)加工條件等各個環(huán)節(jié)都有其獨特性，因此即便是同屬于一個等級的生物，其產(chǎn)品的安全性也明顯不同。此外，就轉(zhuǎn)基因甘蔗而言，考慮的內(nèi)容應(yīng)當(dāng)包括轉(zhuǎn)基因甘蔗品種的審（鑒、認(rèn)）定標(biāo)準(zhǔn)、轉(zhuǎn)基因甘蔗種植與加工、產(chǎn)品銷售相關(guān)規(guī)范或標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)基因甘蔗產(chǎn)品的基因成分檢測，有關(guān)元件如內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的篩選與鑒定、相關(guān)的檢測技術(shù)等，只有這樣才能在保證安全和可控的前提下進(jìn)行轉(zhuǎn)基因甘蔗商業(yè)化應(yīng)用，達(dá)到促進(jìn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)進(jìn)步和保證環(huán)境安全、產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的多重目標(biāo)［81］。

4.5 轉(zhuǎn)基因甘蔗科普宣傳有待進(jìn)一步加強(qiáng)

公眾是轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其產(chǎn)品的最終消費者，對于甘蔗而言，消費者食用的是其加工產(chǎn)品蔗糖，經(jīng)過高溫和多次結(jié)晶后所生產(chǎn)的蔗糖，是不含甘蔗所有基因及其表達(dá)蛋白成分的，當(dāng)然外源基因或基因表達(dá)的蛋白成分也不例外。所以只要相關(guān)知識科普到位，公眾對轉(zhuǎn)基因甘蔗的應(yīng)用推廣及其產(chǎn)品的接受程度是較其他直接食用的作物要高。因此需要政府、科研機(jī)構(gòu)、高等院校等，定期開展轉(zhuǎn)基因科普宣傳、介紹轉(zhuǎn)基因相關(guān)知識并公開與轉(zhuǎn)基因甘蔗相關(guān)的安全評價及監(jiān)管情況資料，提高社會公眾對于轉(zhuǎn)基因甘蔗的認(rèn)知水平。