廢油脂生物合成聚羥基脂肪酸酯的研究進展

潘蘭佳 李杰 林清懷 汪印

（1. 廈門產業技術研究院，廈門 361000；2. 中國科學院城市環境研究所，中國科學院城市污染物轉化重點實驗室，廈門361021）

聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）是微生物細胞內的碳源在氮、磷或硫被限制的條件下的代謝轉化而產生的［1］，是一種可完全生物降解的高分子生物聚酯，其在降解過程中不產生任何有毒化合物［2］。由于PHA具有熱塑性、生物降解性和生物相容性等優點，被視為石油工業塑料的理想替代品，但其較高的生產成本，限制了PHA的產業化生產和大規模應用。目前，工業PHA的價格在2-8美元/kg不等，傳統的聚乙烯和聚丙烯大約只要1.6-1.7美元/kg［3］。然而，為了評估塑料的真實成本，我們必須考慮其對環境的影響和環境修復相關的財政損失［4］。世界各國的研究者們正努力通過各種研究降低PHA的生產成本，可降解的環保塑料必將是未來的發展趨勢。微生物發酵過程中，底物消耗占比較大，選擇價格低廉的底物可以一定程度上降低PHA的生產成本［5］。利用廢棄物作為碳源合成PHA，一方面可解決資源的浪費以及廢棄物污染問題，同時可以降低PHA的生產成本，這將進一步促進PHA的生產和應用。目前被用于PHA生產的廢棄物包括乳清［6-7］、麥麩、米糠［8］、甘蔗糖蜜［9］、廢水［10］和廢油［11］等。本文重點介紹微生物利用廢棄油脂合成PHA。

油脂是人類日常飲食中不可缺少的重要組成部分，它的主要功能是提供熱量以及人體無法合成的脂肪酸和各種脂溶性維生素。據有關部門統計，2010年，我國年消費的食用油約為2 900萬t，產生的廢油量約600萬t，預計到2020年，我國的食用油消費量將成倍增長，而相應的廢油產出量將超過1 000萬t［12］。另外，油脂還具有十分重要的工業用途。一些動、植物油可被用于制作肥皂、表面活性劑和生物柴油等，這些物質生產過程中產生的廢油脂或者副產物積累，將給環境和人類帶來巨大的壓力。因為大量的廢油脂處理不當，會使得有害物質流入生態系統，不僅污染環境，還會危害人體健康。油脂的主要成分是脂肪酸、甘油、維生素和植物甾醇。其作為一種碳氫化合物，可被微生物以碳源形式利用。通過廢棄油脂生物合成可降解塑料-PHA，一方面可以解決廢油脂處理不當帶來的環境污染問題，同時可以實現廢棄物的資源循環利用。

1 PHA在不同領域的應用

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是微生物細胞內碳源和能源的貯藏物質，當培養基中生長所必需的營養物質含量有限，而碳源物質過多時，會促進PHA的積累。這種碳儲存被細菌作為脂肪酸的替代來源，在一定壓力條件下可對其進行代謝，這是它們生存的關鍵機制［13］。到目前為止，已發現包括光能自養菌、化能自養菌和異養菌在內的65個屬300 多個種的微生物細胞可合成PHA［14］，其中包括產堿桿菌屬（Alcaligenes）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸桿菌屬（Enterobacter）、紅桿菌屬（Rhodobacter）、羅爾斯通菌屬（Ralstonia）和貪銅菌屬（Cupriavidus）的細菌。PHA的基本結構及其在細胞中的存在狀態如圖1所示。據統計，至今已有150多種不同結構的PHA被發現。根據單體的碳原子數，PHA可以被分為兩類:短鏈（Short-chain-length，SCL）PHA，其單體由3-5個碳原子組成；中長鏈（Medium-chain-length，MCL）PHA，其單體由6-14個碳原子組成，其分子量多為50 000-20 000 000 Da不等［13］。不同的 PHA單體主要區別于C-3位上側鏈基團的不同，現以側鏈為甲基的聚3-羥基丁酸酯（Poly3-hydroxybutyrate，PHB）最為常見［15］。由于PHA的單體種類多樣、彼此之間鏈長差別很大，導致不同的PHA 物理化學結構和材料學性質有很大的差異［2］。當PHA為短鏈時，具有良好的熱塑性；PHA為中長鏈時，具有良好的彈性［16］。PHA具有許多和聚丙烯塑料類似的性質，如具有良好的防潮性能、氣體阻隔性、抗水解性和耐紫外線的性能等。除此之外，PHA還具有一些獨特的性質，包括生物相容性、生物降解性［17］和光學異構性［18］，甚至具有壓電材料的特性，其在塑料包裝、化工、醫藥、農業、生物能源等諸多領域具有廣闊的應用前景（圖2）。

圖1 PHA的結構式及其在細胞中的存在狀態［19］

PHA在塑料工業領域經歷了四代產品的更新換代。第四代PHA材料是3-羥基丁酸-4-羥基丁酸共聚酯（P3HB4HB），可通過調節其單體比例，獲得所需性能的材料，由于其具有生物降解性，已成為制造綠色包裝材料的首選原料。PHA可以用于生產各種產品，包括塑料袋、餐具、化妝品容器和食品包裝材料等［20］。另外，PHA良好的免疫耐受性、低毒性、生物降解和生物相容性，使其在醫藥行業具有廣闊的應用前景。首先，可用于外科縫合、皮膚替代品、植入物、紗布、血管、組織支架和骨折固定板等［21］。聚羥基辛酸酯和聚4-羥基丁酸酯由于柔韌性較強，最早被應用于血管組織工程的研究；短鏈 PHA，如 PHB 和 3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚酯（PHBV）可作為構建骨組織工程支架的原料［22］。另外，PHA還可制備緩釋材料，作為藥物基質植入人體后，隨著藥物釋放，能降解為可被人體自行代謝而沒有任何毒副作用的物質［23］。近幾十年來，可生物降解聚合物還以納米顆粒、納米膠囊、微顆粒、微膠囊和微/納米球等形式作為藥物載體，得到了廣泛的應用［16，24］。以PHB微球為載體，制備的抗腫瘤藥物在小鼠體內的實驗結果表明，含有變紅菌素的PHB微球作為抗腫瘤藥物可有效抑制癌細胞的增殖［25］。在農業方面，PHA已被用作農業用途的地膜制造［26］，還可以作為除草劑的載體和控釋劑，控制釋放以減少除草劑對非目標物種的影響和重復使用的需要［27］。在畜牧業方面，PHA可作為飼料添加劑為動物提供額外的營養物質［28］。已有研究表明水產養殖水體中加入PHA可有效控制水中病原菌的生長，防止水產動物感染，并且促進動物生長［29］。另外，PHA還可制成生物燃料，其水解后再經甲基酯化反應可生成3-羥基烷酸酯甲酯，其能量可與生物乙醇相媲美［30-31］；由于PHA還具有光學活性，可應用于色譜中分離手性物質。在環保材料方面，PHB還被成功制備為吸附劑，可去除水中脂溶性有機污染物的能力［32］。而且現在十分熱門的納米材料也希望通過PHA的添加形成復合材料，獲得更優異的性能［26］。

2 微生物利用廢油脂合成PHA

2.1 餐廚廢油

圖2 PHA在不同領域的應用

餐廚廢油一般是指地溝油、潲水油、煎炸廢油、動物廢棄油脂等［33］。在過去的幾十年里，食用油回收行業得到了大力發展。餐廚廢油不再被視為廢棄物，而是成為一種有價值的商品，尤其是用于生物柴油生產。餐廚廢油具有低市場價值，高含碳量等優點，可作為微生物培養的有效碳源［34］。目前已有多項研究對其生物轉化為PHA的潛力進行了評價。以餐廚廢油作為PHA的合成底物，可以至少降低50%的生產成本。而且有研究者發現利用油脂合成PHA的能耗以及CO2的排放量少于利用葡萄糖作為底物合成PHA的值［35］。

近年來，關于微生物利用餐廚廢油合成PHA的研究大多數是利用單一組分的油為底物，而利用混合廢油（煎、炸、炒、蒸、煮等餐廚混合廢油）為底物的研究較少。Obruca等［36］以廢棄菜籽油為底物，利用Cupriavidus necatorH16生產PHB，通過連續培養，72 h 之后PHB產量可達105 g/L，并且發現1%丙醇（V/V））可以顯著促進PHA和生物量的累積。Obruca等［7］還發現利用煎炸廢油為碳源，蛋白酶水解的乳清為氮源，Cupriavidus necatorH16在70 h可合成14.5 g PHB。與其它氮源相比，利用水解乳清為氮源，PHB的累積量提高了3.5倍以上。Verlinden等［37］同樣利用Cupriavidus necator為實驗菌種，以煎炸廢油為底物生產PHA，72 h產量可達1.2 g/L。種宇軒等［38］以煎炸廢油作為發酵過程中的碳源，對Cupriavidus necator合成PHA過程進行了條件優化，結果表明當初使pH值為7.5、裝液量為100 mL/250 mL、培養溫度為28℃、接種量為3%、轉速為160 r/min、廢油添加量為25 mL/L進行發酵培養時，PHA的產量可達到6.63 g/L，約占到細胞干重的83%。根據文獻報道，菌種Cupriavidus necator已成為利用脂質類底物生產PHA的常用菌株，并且有研究者嘗試用其以混合的餐廚廢油為底物合成PHB，結果顯示其對PHB的積累在2 d之內可以達到細胞干重的63%左右［39］。Cruz等［40］通過溶氧控制補料模式以及氫氧化銨同時作為pH調節劑和氮源的方式，使得菌株Cupriavidus necatorDSM 428利用餐廚廢油合成PHB的效率達到12.6 g/L/d。另一常用的以油脂為底物合成PHA的菌種為真氧產堿桿菌（Ralstonia eutropha）。Kahar 等［41］利用Ralstonia eutrophaH16 為實驗菌種，以廉價大豆油為碳源生產PHA，產物含量可達細胞干重的72%-76%（W/W）。Park等［42］研究了菌株Ralstonia eutrophaKCTC 2662以及大豆油合成PHA的能力發現，其以大豆油為單一碳源合成的PHA可占菌體細胞干重的70%-83%，產率為0.80-0.82 g-PHA/g-油。另外，一些假單胞菌和伯克霍爾德菌也可將餐廚廢油轉化為PHA。Fernandez等［43］通過Pseudomonas aeruginosa 42A2 利用廢棄的烹飪油和其他廢油生產PHA，該菌株可以積累54.6%的PHA。菌株Burkholderia thailandensis最早是從泰國中部某稻田土壤樣品中分離得到的。Kourmentza等［44］首次報道通過B. thailandensis利用餐廚廢油合成PHA，并發現合成的PHA是PHB均聚物。

2.2 其它廢油

生物柴油作為一種典型的綠色能源，受到各界普遍關注。但生物柴油生產過程中會有大量的副產物甘油累積，而甘油中較多的雜質使其利用價值較低。因此，利用甘油作為合成PHA的低成本碳源也受到廣泛的關注。Canadas等［45］將廢棄的甘油作為菌株Cupriavidus necatorDSM 545合成PHA的主要碳源，聚合物的濃度可以達到9-25 g/L，并成功將該聚合物制備為用于干細胞培養的電紡纖維支架。de Paula等［46］從土壤中分離得到一株新菌Burkholderia glumaeMA13，其以粗甘油為單一碳源可合成PHB（含量可達菌體干重的51.3%），該菌在甘油外加丙酸或己酸則可合成3-羥基丁酸-3-羥基戊酸共聚酯或3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯，有效改善PHB聚合物的性質。Mohandas等［47］首次報道了海洋嗜鹽菌Bacillus cereus可將甘油轉化為PHA，最佳條件下PHA的含量可達68.12%。粗甘油還通過假單胞菌合成均勻性較好的中鏈PHA，有利于其在工業上的應用［48］。此外，一些其它的廢油脂，如咖啡渣廢油、廢棄棕櫚油等也具有合成PHA的潛力。咖啡作為僅次于石油的世界第二大貿易商品，消耗之后將留有大量殘渣。將咖啡渣收集，并作為生產其它高值化產品的原料，將在一定程度上減輕環境壓力，降低生產成本。目前，咖啡渣提煉的廢油已被用于生產 PHB［49-50］。Bhatia等［51］利用工程菌以咖啡油為底物合成3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯，該聚合物的產量可達到菌體細胞干重的69%。棕櫚油是食用油的一種，不僅在食品和餐飲行業被廣泛應用，還常用于工業生產。棕櫚油用于制造肥皂后的皂化殘油難以回收再利用，有研究者以其作為合成PHA的原料，通過菌株Pseudomonas sp. Gl01的轉化，中鏈PHA的含量可以達到43%［52］。本著廢物再利用原則，另有學者利用生產人造奶油過程中產生的含油廢物為原料，利用菌株Cupriavidus necator，Comamonas testosteroni和多種假單胞菌進行轉化合成。Cupriavidus necator的效果最佳，20 h的PHA產量為6.4 g/L［53］。還有研究者利用植物油生產過程產生的廢水和污泥中的殘油進行PHA合成實驗，結果表明該物質在合成PHA方面具有較高的潛力［54-55］。

2.3 油脂合成PHA的轉化機制和難點

油脂與其它碳源不同，其理論PHA的產額系數每克植物油可合成超過1.0 g PHA，因為油脂碳鏈長，可以水解為許多短鏈的脂肪酸，而脂肪酸通過β-氧化途徑被利用，直接生成PHA的前體—?；o酶A［7］。如圖3所示，為了達到廢油脂合成PHA的目的，可以首先在酸性或堿性條件下使油脂水解為脂肪酸，水解產物與PHA合成菌共同培養之后，脂肪酸進入菌體細胞在轉運蛋白和酰基輔酶A合成酶的作用下生成?；o酶A。短鏈PHA即聚羥基丁酸酯是由乙酰輔酶A直接在β-酮硫解酶和乙酰乙酰輔酶A還原酶的作用下生成［51］；而對于大部分中鏈PHA則是?；o酶A經過脫氫反應生成烯脂酰輔酶A，該物質再經過烯脂酰輔酶A水合酶的作用生成羥烷基輔酶A，進一步在PHA合成酶催化生成PHA。在整個β-氧化的過程中，羥烷基輔酶A會通過循環部分分流，在烷基輔酶A脫氫酶（fadB）作用下生成酮脂酰酶A。因此，為了促進PHA的合成量，可以考慮敲除基因fadB，甚至是將fadB和fadA兩個基因都敲除，減少烷基輔酶A的代謝通量。酮脂酰酶A硫解酶（fadA）和羥烷基輔酶A脫氫酶（fadB）是催化β-氧化過程的兩個重要的酶。多項研究表明fadA、fadB兩個基因敲除以后，產生的突變體可以合成比野生菌株更多的PHA［56-58］。但是以上提及的基因敲除實驗都是基于菌株利用純的、單一的脂肪酸來合成PHA，關于利用廢油脂為底物的研究尚未有發現。廢油脂成份復雜，脂肪酸組分復雜，具體的基因敲除效果導致的PHA合成和菌體生長情況還需要進一步實驗驗證。

雖然廢油的利用是有利的，但雜質的存在和每次廢油成分的變化也會導致最終PHA產量的變化。這些因素造成不同的產出，在進行批量試驗之前需在實驗室規模上進行實驗優化。因為一旦使用了新一批的廢油，就會導致額外的成本和產出的不確定性［59］。另外，雖然利用廢油合成PHA與減少廢油處理問題存在實質利益有關，但筆者建議廢油合成PHA的成品不能用于醫療應用。因為在醫療應用中，最需要考慮的是材料的安全性和無毒性。廢油脂生產的PHA可能具有病毒、質粒、細菌或其它污染，使其無法用于醫療級別的應用［60］。如果廢油脂生產的PHA要用于醫療，一些雜質則需經過多重步驟的純化去除，但最終會導致產品成本增加。

圖3 油脂合成PHA的途徑和相關控制基因［21，51］

3 PHA的提取方法

PHA在微生物細胞內積累，因此為了得到它，要將其與非PHA等細胞物質分離。圖4為PHA提取的流程圖，簡單介紹了PHA從微生物細胞到高純度成品的幾個步驟。菌體在進行PHA提取之前，首先要通過離心收集，以油脂作為合成底物的需要利用正己烷將菌體表明的油脂去除，并用去離子水洗滌。獲得的菌體經過冷凍干燥處理之后可用于提取步驟。許多研究顯示，PHA可以通過利用多種不同的溶劑萃取獲得。該方法不但提取出的PHA純度高，而且能保持生物聚合物的理化性質不改變。另外，在提取之前，對細胞進行研磨、高壓均化、超聲破碎等前處理，可以提高PHA的提出率。以下主要介紹幾種常用的PHA提取方法。

圖4 PHA分離純化流程圖

3.1 有機溶劑提取法

PHA提取常用的方法為索氏提取法。直接利用有機溶劑在高溫下抽提凍干的微生物細胞中的PHA，使用的有機溶劑多數為氯仿。抽提結束后冷卻、過濾，隨之將氯仿相逐滴滴入冷甲醇中。冷甲醇作為非溶劑，PHA會在其中沉淀析出，最后通過離心、干燥獲得PHA［44，61］。另外，還可直接使用有機溶劑提取，省去索氏提取的步驟和裝置，先將凍干的細胞破碎后加入有機溶劑，在高溫下提取。一段時間后，過濾獲得的有機相同樣通過非溶劑法沉淀析出PHA。Taniguchi等［61］利用有機溶劑提取法提取PHA是直接將干的細胞置于氯仿中，在室溫下提取3 d。López-Cuellar等［62］直接將細胞加入氯仿中煮沸10 min，過濾后利用冷甲醇析出PHA。Simon-Colin等［63］利用研缽將凍干的細胞磨碎后加入氯仿中，在50℃下提取4 h。之后將氯仿相濃縮，去除雜質后蒸干氯仿獲得粗提的PHA。除了氯仿之外，二氯乙烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷等有機溶劑也被用于從破裂的細胞生物質中溶解PHA。其它的有機溶劑如四氫呋喃甲基氰、四氫呋喃乙基氰和乙酸酐等也被嘗試使用，但這些試劑的提取回收率并不高。溶劑萃取法獲得的PHA純度高且不降解聚合物，還能去除細胞的內毒素［64］。但有機溶劑的污染大，使用后需要考慮回收問題。

3.2 雙水相萃取法（Aqueous two phase extraction，ATPE）

雙水相萃?。ˋTPE）是一種獨特的液-液萃取技術，它將溶質從一個水相轉移到另一個水相。ATPE通常包括聚合物-聚合物型和聚合物-無機鹽型兩種體系［65］。在水中以一定的濃度混合后形成的互不相溶性的兩相或多相，并利用溶質在兩相的分配系數的差異進行萃取。由于雙水相體系含水量高達70%-90%，是在接近生理環境的溫度和體系中進行萃取［21，66］，并且該體系對生物分子具有較高的選擇性和回收率［67］，因此它被廣泛應用于生物技術領域分離純化各種生物制品，如氨基酸、酶、抗體等［68］。該法近年也被用于PHA的提取，與溶劑萃取法相比雙水相萃取是一種環保的提取方法［69］。雙水相體系統采用水相分離純化PHA，并且可以從中去除不需要的雜質［16］。Divyashree等［70］利用雙水相萃取法從彎曲芽胞桿菌中提取PHA回收率可達51%，利用的兩相分別是12%（W/V）聚乙二醇和9.7%（W/V）磷酸鉀。現還有利用熱分離聚合物和水組成的新型雙水相體系對PHA進行分離。常用的熱分離聚合物是環氧乙烷（Ethylene oxide，EO）和環氧丙烷（Propylene oxide，PO）的隨機共聚物（簡稱EOPO聚合物），其溶液隨著溫度的升高熱分解為兩相。最終目標產物可以在水相中回收，而共聚物可以回收再利用。Leong等［71］在EOPO 3900濃度為14 wt/wt%，硫酸銨濃度為14 wt/wt%，pH為6的條件下進行細菌細胞中的PHA提取，過程中無需額外離心步驟，PHA的回收率可達72.2%。

3.3 消化法

消化法是溶劑萃取法的替代方法，包括化學法消化和酶法消化。這兩種都能消化細胞中的非PHA物質。在化學方法中，通常使用表面活性劑或次氯酸鈉來促進細胞中PHA的釋放。表面活性劑如十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）可以通過與細胞的磷脂膜結合從而破壞細胞，使得PHA以細胞碎屑的形式釋放。表面活性劑還有溶解蛋白質和其它非PHA物質的作用［72］。但是，單獨使用表面活性劑獲得的PHA純度不高，因此需要同時添加一些別的物質如次氯酸鹽和氫氧化鈉［73］。表面活性劑Triton X-100、棕櫚酰肉堿和甜菜堿均用于化學消化。另一種化學消化是次氯酸鈉消化，但僅用次氯酸鈉會導致高達50%的聚合物被降解。因此，最終發展為次氯酸鈉和氯仿消化法，結合次氯酸鈉消化法和溶劑提取法的優點，通過次氯酸鈉破壞細胞并消化非PHA物質，同時利用氯仿將PHA提取至有機相部分［73］。酶消化包括熱處理、酶水解和表面活性劑洗滌等步驟［64］。由于酶具有特異的靶向性，一些酶（如蛋白酶）對蛋白質具有較高的溶解性，而對PHA幾乎無影響，因此 PHA的回收率較高。酶法消解最主要的缺陷在于其成本較高。

3.4 其它方法

超臨界流體具有氣體和液體的雙重特性，其黏度與氣體相似，但擴散系數比液體大得多，其密度和液體相近。超臨界流體對物質進行溶解和分離的過程就叫超臨界流體萃取。超臨界溶劑萃取法具有低毒性和低成本等優點，其中超臨界二氧化碳由于其溫和的溫度和壓力，被用于工業上的細菌PHA提取。除二氧化碳氣體外，超臨界流體法還可用氨和甲醇對進行PHA回收［74］。與傳統萃取工藝相比，超臨界溶劑萃取法可使回收的PHA純度達到100%，雜質含量比傳統萃取工藝的少150倍［16］。

4 總結和展望

聚羥基脂肪酸酯（PHA）作為一種綠色塑料，在生產和回收方面具有積極的社會和環境影響。但由于其生產成本高昂，發展受到極大限制，價格與普通的聚丙烯塑料相比沒有競爭優勢。使用廢棄物作為碳源生產PHA將是一個研究熱點。利用廢油脂合成PHA，一方面可以為廢油資源化利用開辟新的途徑；另一方面合成的環境友好型材料可替代傳統塑料，減輕環境污染。已有的相關研究大多數還處在實驗室規模的實驗階段，距離真正實現廢油脂合成PHA的商業化程度還有很大差距、需要進行大量的研發。并且需要考慮如下幾個問題:（1）餐廚廢油成分復雜，其中不可避免含有對發酵微生物生長不利的物質，導致PHA的合成效率較低，因此需要如何提高微生物利用廢油脂合成PHA的效率；（2）復雜的成分會導致合成的PHA為多種單體的混合物，此情況是否會影響PHA的物理化學性質；（3）如何將不同的PHA單體有效分離或是能通過什么方式使其僅合成一種單體，這都將是有待解決的重要問題。另外，在實驗室層次的研究，對于PHA的提取大多使用的是有機溶劑提取法，擴大生產之后使用此方法，則將消耗大量的有機溶劑，對環境造成威脅，進而違背我們可持續發展的初衷。因此，還需大力開發有效、經濟且環保的PHA提取方法，從多方面控制PHA的生產成本、消耗和排放。