實時熒光定量PCR技術在手足口病檢測中的應用

趙禹

[摘要] 目的 探討實時熒光定量PCR技術在手足口病檢測中的應用。 方法 選擇本溪市疾病預防控制中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口病患兒作為研究對象，根據檢測方法不同分為對照組和觀察組。對照組利用常規PCR技術檢測手足口病組，實時熒光定量PCR技術檢測手足口病為觀察組。比較兩組的檢出腸道病毒分型EV、EV71、CoxA16陽性率，特異性和靈敏度。 結果 采用實時熒光定量PCR技術與常規PCR技術檢測手足口病腸道病毒分型EV、EV71、CoxA16的陽性率及兩組特異性和靈敏度相比，觀察組檢測陽性率為66.67%，明顯高于對照組檢測陽性率的21.67%，觀察組檢出陽性率高于對照組，兩組均有特異性，觀察組靈敏度優于對照組，對照組最低檢測限均為4.11×103 cfu/mL。而觀察組均為4.11×102 cfu/mL。 結論 熒光定量PCR技術在檢測腸道病毒中不僅具有特異性高，還具有靈敏度高、檢測時間快的特點，有助于更快診斷手足口病，更好的服務于臨床。

[關鍵詞] 手足口病;熒光定量PCR;柯薩奇病毒A組16型;腸道病毒71型

[中圖分類號] R440 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）15-0148-03

Application of real-time fluorescent quantitative PCR technology in detection of hand-foot-mouth disease

ZHAO Yu

Department of Microbiology， Benxi Center for Disease Prevention and Control in Liaoning Province， Benxi ? 117000， China

[Abstract] Objective To explore the application of real-time fluorescent quantitative PCR technology in the detection of hand-foot- mouth disease. Methods A total of 120 children with hand-foot-mouth disease treated in Benxi Center for Disease Prevention and Control from February 2018 to June 2019 were selected as research subjects. They were divided into the control group and the observation group according to different detection methods. Patients with hand-foot-mouth disease detected by conventional PCR technology were classified as the control group， and those detected by real-time fluorescent quantitative PCR technology were classified as the observation group. The positive rates， specificity， and sensitivity of enterovirus（EV） typing， enterovirus 71（EV71）， and coxsackievirus A16（CoxA16） were compared between the two groups. Results The positive rates of EV typing， EV71， and CoxA16， specificity and sensitivity in detection of hand-foot-mouth disease using real-time fluorescent quantitative PCR and conventional PCR were compared. The positive rates in the observation group and the control group were 66.67% and 21.67%， respectively. The positive rate in the observation group was significantly higher than that in the control group. Specificity was showed in both groups. The sensitivity in the observation group was higher than that in the control group. The minimum detection limit of the control group was 4.11×103 cfu/mL and that of the observation group was 4.11×102 cfu/mL. Conclusion Fluorescent quantitative PCR technology is with high specificity， high sensitivity and fast detection time， which benefits the faster diagnosis of hand-foot-mouth disease and serves clinical care better.

[Key words] Hand-foot-mouth disease; Fluorescent quantitative PCR; Coxsackievirus A16; Enterovirus 71

手足口病主要致病菌是腸道病毒，該傳染病的主要傳播途徑是通過消化道、呼吸道和密切接觸等[1]，人群較易受感染，但多見于嬰幼兒。其發病率最高人群為5歲以下兒童，腸道病毒可以引起多種傳染病如脊髓灰質炎、柯薩奇病毒、手足口病等，但引起手足口病最為常見的是腸道病毒71型（Human enterovirus 71， EV71）和柯薩奇病毒A組16型（CoxsackievirusA16，CoxA16），但近年來引起并發癥主要以EV71分型為主，該病的發病流行特點是一年四季均可以發病，尤以夏秋季節最多見[2]。臨床表現以手、足、口腔等部位的斑丘疹、皰疹為特征，但部分的EV71感染者可出現無菌性腦膜炎、神經性肺水腫、心肌炎、循環障礙等危重并發癥，感染腸道病毒分型EV71是死亡的主要原因，目前缺乏有效的治療藥物，本病傳染性強，易引起暴發或流行[3]。以前的實驗室診斷手足口病中的腸道病毒病原體的方法是血清學方法和病毒分離培養，但這兩種方法有檢測速度慢、耗時長的局限性，且對專業人員的技術要求門檻高，無法準確對暴發疫情做出應有的診斷和治療，因此本文選擇我中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口患兒作為研究對象，并取得了較好的療效，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本溪市疾病預防控制中心2018年2月～2019年6月收治的120例手足口病患兒的病歷資料，根據檢測方法不同分為對照組和觀察組，每組各60例。對照組男48例，女12例;年齡0～4歲，平均（3.50±0.35）歲;病程2～10 d，平均（7.78±0.81）d;觀察組：男37例，女23例;年齡0～3歲，平均（2.40±0.47）歲，病程3～9 d，平均（7.53±0.77）d。納入標準：經腸道病毒傳染者;出現口痛、厭食、低熱者。手、足、口腔等部位出現小皰疹或小潰瘍且大多1周左右可自愈者。排除標準：既往有其他感染癥狀者;手、足、口腔等部位有皰疹或潰瘍且較難自愈者;免疫力低下者;嚴重心、肝、腎功能異常者[4]。幼兒手足、臀部皮疹及口腔皰疹和潰瘍的臨床表現應考慮手足口病。臨床診斷具有下列之一的特點即可確診為手足口病：一、腸道病毒特異性核酸（EV71、CoxA16）檢測陽性;二、分離腸道病毒病并鑒定為EV71、CoxA16或者其他腸道病毒;三、急性期與恢復期血清腸道病毒特異性中和抗體滴度4倍以上。手足口病診斷標準嚴格按照《感染病學八年制教材第3版》[5]進行。兩組患者的性別、年齡等資料比較差異無統計學意義（P>0.05）。該研究得到本溪市疾病預防控制中心倫理委員會的批準，每例患兒家屬均簽署了知情同意書。

1.2 標本運送和保存

相應的科室采集后的標本應存放于相應的標本保存液，及時冷藏運至實驗室以免耽誤最佳檢測時間。實驗室檢測樣本完成后應立即放入-80℃ 冰箱保存。低溫保存使病原體的活性降低。

1.3 主要儀器及試劑

實時熒光PCR儀購于美國應用系統公司ABI7500，凝膠成像儀購于美國BIO-Rad UV HOODⅡ。RNA提取、實時熒光定量PCR試劑均購自美國QIAGEN公司;腸道病毒通用型核酸檢測試劑盒（Human enterovirus，EV）、（EV71）和（Cox A16）均購于上海之江公司生產，瓊脂糖購自GIBIO公司。所有試劑均在有效期內使用。引物探針EV、EV71 和 Cox A16序列在Gen Bank數據庫搜索且設計。常規PCR引物序列參考《手足口病防控指南》中的引物設計，由生工公司合成。

1.4 操作方法

1.4.1 熒光定量PCR檢測手足口病的病原體的操作標準 ?流程嚴格按照購買試劑盒的方法執行，先按照試劑盒提取病毒RNA后按PCR總體系25 μL和PCR反應條件：45℃10 min→95℃15 min→95℃15 s → 60℃60 s循環40次進行擴增。

1.4.2 ?常規PCR檢測手足口病的病原體操作標準 ?流程如下：先用Primer 5.0設計引物由特定的生物公司合成，其次試劑盒提取病毒RNA，PCR總體系25 μL依次加入Taq酶，逆轉錄酶，反應液，質控液等。PCR反應條件：45℃10 min→95℃15 min→95℃15 s→60℃60 s循環40次進行擴增，結束后2%瓊脂糖進行電泳，用凝膠成像儀觀察 PCR產物并拍照電泳結果。

1.5 觀察指標

觀察并記錄兩組腸道病毒分型EV、EV71、CoxA16陽性率、特異性、靈敏度。該研究陽性率通過χ2檢驗計算而得，該研究采用實時熒光定量PCR技術方法和常規PCR技術方法分別檢測腸道病毒的陰性和陽性來確定其特異性。檢測系列稀釋的已知拷貝數的RNA 濃度根據最低效價比來確定其靈敏度[6]。

1.6 統計學分析

本研究所有數據均采用統計學軟件SPSS 20.0分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數資料以（%）表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組腸道病毒陽性率檢測結果比較

對 120份咽拭子標本同時進行兩種方法的檢測，其中觀察組檢測陽性率為66.67%，明顯高于對照組檢測陽性率的21.67%。觀察組檢出 EV陽性13份，EV 71陽性19份、Cox A16陽性8份，陰性份數20份，對照組檢出 EV陽性5份，EV 71陽性6份、Cox A16陽性2份，陰性份數47份。觀察組檢出陽性率高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.2 兩組腸道病毒及分型的特異性比較

兩組通過腸道通用反應液、V71反應液、CoxA16對腸道病毒EV、EV71、CoxA16、諾如病毒、輪狀病毒進行特異性比較，發現兩者結果一致，說明兩組對檢測手足口病均有特異性。見表2。

2.3兩種方法檢測腸道病毒的靈敏度分析

將手足口病菌懸液濃度為4.11×107 cfu/mL 進行 10 倍梯度稀釋，比較兩種方法的檢測手足口病的靈敏度，發現對照組最低檢測限均為4.11×103 cfu/mL。而觀察組最低檢測限均為4.11×102 cfu/mL，由此可知觀察組的檢測靈敏度高于對照組。見表3。

3 討論

手足口病的發病機制是病毒從咽部或腸道侵入，在局部黏膜和淋巴組織中繁殖并引起局部的癥狀[7]。該病的臨床特征是低熱、手、足、口腔等出現小皰疹或者小潰瘍，絕大數患兒7 d左右自愈，少數患兒可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發癥[8]。該病流行特點是有明顯的季節性和聚集性。該病分布廣泛，傳播速度較快且傳染性強，隱性感染者居多，顯性感染者和隱性感染者之比為1：100[9]，所以早期發現該病有利于疾病的控制。既往引起手足口病的病毒CoxA16，之后發現EV71病毒才是引起本病的危險因素，本研究發現分離EV71陽性率高于CoxA16，與國內數次暴發的此病的特點具有一致性[10]。早期用于檢測腸道病毒的方法是血清學方法和病毒分離法，但兩種方法具有操作復雜、耗時、準確率低的特點，不能滿足快速診斷該病的需要[11-13]。隨著醫學技術的發展，近年來國內常用檢測手足口病的方法是常規PCR方法，雖然此方法也可以快速檢測病毒核酸，但易產生污染，且此過程需要溴化乙錠等染料具有致癌性。熒光定量PCR技術是目前國際上檢測手足口病病毒最先進的檢查方法，因為熒光定量PCR技術具有以下的優點：一、高靈敏性和準確性，對于DNA濃度要求低。二、操作簡單、耗時少。三、安全、無污染，因為都在封閉狀態下進行PCR擴增和產物分析，不需要瓊脂糖電泳和紫外照射。四、結果重復性好，實時觀測結果、判斷直觀、避免人為因素干擾[14]。熒光定量PCR技術在檢測手足口病病毒全程只需3個多小時，為快速診斷手足口病提供最快的實驗室檢測手段，有助于手足口疫情的監測。

本研究同時采用兩種PCR技術檢測手足口病病原體，此兩種實驗技術分別是實時熒光定量PCR和常規PCR。且這兩種方法檢測手足口病的陽性率分別為66.67%和21.67%，此次研究結果表明實時熒光PCR法檢測手足口病陽性率明顯高于常規PCR，差異有統計學意義（P<0.05），說明實時熒光定量PCR避免漏檢的風險，為臨床提供準確的結果有利于早發現疫情。該研究采用實時熒光定量PCR技術方法和常規PCR技術方法分別檢測腸道病毒的陰性和陽性來確定其特異性，發現兩者檢測陰性和陽性是一致的，所以兩者方法都具有特異性，證明采用PCR技術診斷該病具有特異性，防止臨床上漏診誤診的風險。通過檢測系列稀釋的已知拷貝數的RNA 濃度根據最低效價比來確定其靈敏度，發現對照組最低檢測限均為4.11×103 cfu/mL。而觀察組最低檢測限均為4.11×102 cfu/mL，證明熒光定量PCR技術具有更高的靈敏性，有利于疾病的檢出。此研究與王冰等[15]研究結果一致，表明實時熒光定量PCR技術比常規PCR技術在檢測手足口病更有優勢，為臨床手足口病防治提供了依據。

綜上所述，熒光定量PCR技術在檢測腸道病毒不僅具有特異性高，還具有靈敏度高、檢測時間快的特點，有助于更快診斷手足口病，更好的服務于臨床。

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（收稿日期：2019-12-13）