胎兒生長受限胎盤滋養細胞凋亡相關因子P53、bcl-2、bax的表達

姜丹 于晶功 孫寒冰

[摘要] 目的 探討胎兒生長受限（fetal growth restriction，FGR）患者胎盤滋養細胞凋亡相關因子P53、bax、bcl-2的表達及意義。 方法 收集2014年3月～2017年6月大連市婦女兒童醫療中心剖宮產分娩患者的胎盤，其中正常妊娠晚期（對照組）、FGR（實驗組）各50例。應用免疫組化S-P法檢測兩組胎盤滋養細胞凋亡相關因子P53、bcl-2、bax的表達。 結果 實驗組bax蛋白表達明顯高于對照組，差異有顯著性（P<0.05），實驗組bcl-2蛋白表達低于對照組，差異有顯著性（P<0.05）。P53蛋白在正常妊娠晚期、FGR組均未見表達或僅有個別細胞表達，差異無顯著性（P>0.05）。 結論 FGR患者胎盤滋養細胞凋亡是非P53依賴的凋亡，凋亡相關因子bax、bcl-2蛋白可能共同介導FGR胎盤滋養細胞的凋亡。

[關鍵詞] FGR;凋亡;P53;bax;bcl-2

[中圖分類號] R714.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] B ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）15-0151-04

Expression of factors P53， bcl-2 and bax related to trophoblast cell apoptosis in FGR placenta

JIANG Dan1 ? YU Jinggong2 ? SUN Hanbing2 ? Liu Yuanyuan1 ? ZOU Na1

1.Department of Pathology， Dalian Municipal Women and Children's Medical Center， Dalian ? 116000， China; 2.Department of Pathology， Dalian Maternity Hospital， Dalian ? 116000， China

[Abstract] Objective To explore the expression and significance of factors P53， bax and bcl-2 related to trophoblast cell apoptosis in patients with fetal growth restriction（FGR） placenta. Methods Placentas of patients who experienced Cesarean section from March 2014 to June 2017 in Dalian Municipal Women and Children's Medical Center were collected， including 50 cases of normal late pregnancy（the control group） and 50 cases of FGR（the experimental group）. Immunohistochemical S-P method was used to detect the expression of factors P53， bcl-2 and bax related to trophoblast cell apoptosis in the two groups of placentas. Results The expression of bax protein in the experimental group was obviously higher than that in the control group， and the difference was significant（P<0.05）. The expression of bcl-2 protein in the experimental group was significantly lower than that in the control group（P<0.05）. P53 protein was not expressed in the normal late pregnancy and FGR groups or was only expressed in a few cells， with no significant difference（P>0.05）. Conclusion Apoptosis of placental trophoblast cells in FGR patients is non-P53-dependent apoptosis， and apoptosis-related factors bax and bcl-2 proteins may jointly mediate apoptosis of FGR placental trophoblast cells.

[Key words] FGR; Apoptosis; P53; Bax; Bcl-2

胎兒生長受限（fetal growth restriction，FGR）是產科常見并發癥及嚴重影響圍產兒預后甚至死亡的病理妊娠過程，其臨床診斷標準為胎兒的出生體重低于同孕齡胎兒平均體重的第十個百分位數或兩個標準差。FGR不僅影響胎兒發育，對兒童期、青春期等智力、體能等都有遠期潛在影響。FGR的發病原因除外母體營養供應、胎盤轉運、胎兒遺傳等相對明確的病因外，還有約40%的患者發病病因尚不明確[1]。有文獻報道，不明原因的FGR發生與胎盤滋養細胞侵襲不徹底有關[2]，絨毛發育障礙，侵襲過淺，母體則無法通過胎盤供應給胎兒充足的血液及營養。在FGR的發病機制中，有關滋養細胞凋亡異常及凋亡的調控機制被廣為關注。在妊娠期的整個過程中均存在著胎盤的滋養細胞凋亡，任何凋亡狀態的異常均會引起胎盤滋養細胞的侵襲障礙，導致FGR病理妊娠的發生[3]。本課題組經前期研究發現FGR胎盤滋養細胞存在凋亡增加的現象[4]，現用免疫組化方法檢測凋亡相關因子p53、bax、bcl-2的表達與FGR胎盤滋養細胞凋亡的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年3月～2017年6月大連市婦女兒童醫療中心及大連市婦幼保健院住院分娩患者妊娠晚期剖宮產的胎盤，對照組50例，臨床診斷為FGR的患者胎盤，實驗組50例，對照組與實驗組均除外產婦有其他產科或內科等并發癥。產婦均無不良嗜好，無特殊疾病感染病史，非試管嬰兒，產婦年齡25～33歲，平均（30.3±2.5）歲，孕周35～40周，平均（36.8±2.3）周。所有選取的產婦均為單胎剖宮產，自然受孕，產兒均為活胎，Apgar評分8～10分。兩組產婦的年齡、孕周等臨床資料差異無統計學意義（P>0.05）。送檢胎盤的取材均為臨床常規正常送檢胎盤，經產婦及家屬知情同意。

1.2 主要方法

1.2.1 實驗試劑及實驗儀器 ?鼠抗人P53、bax、bcl-2單克隆抗體、DAB染色液、SP免疫組化試劑盒等均購自基因科技（上海）有限公司。全自動組織切片機LeicaRM2255，全自動組織脫水機Thermo_Excelsior_ES，全自動免疫組化儀Roche Benchmark XT，olympus顯微鏡BX41。

1.2.2 實驗方法 ?送檢胎盤，選取胎盤母體面中央區，避開邊緣區，出血、鈣化、機化、血栓等區取材，0.9%氯化鈉注射液沖洗三次，10%福爾馬林固定36 h，常規石蠟包埋、組織切片、HE染色、免疫組化SP染色。

免疫組化SP法檢測P53、bax、bcl-2蛋白在實驗組及對照組胎盤滋養細胞中的表達：參考基因科技P53、bax、bcl-2免疫組織化學檢測試劑盒說明書，組織切片按病理學常規脫蠟，水化，抗原熱修復，PBS沖洗，過氧化物酶孵育12 min，加一抗，37℃水育60 min，PBS沖洗3次，每次10 min，加二抗37℃水育30 min，PBS沖洗3次，每次10 min，顯微鏡下根據染色實際情況而定，DAB顯色5～10 min終止顯色，蘇木素復染，梯度酒精脫水，樹膠封片，光學顯微鏡下觀察免疫組化染色表達強度并拍照。

1.2.3 實驗結果判定方法 ?免疫組化半定量結果判讀：光學顯微鏡下采用組織標本滋養細胞的細胞膜或細胞漿中有淺黃色至棕褐色顆粒沉積為陽性的判讀標準。每張免疫組化染色切片隨機選取15個高倍（×400）視野，按每張切片滋養細胞陽性細胞著色的百分比例以及著色的強度深淺進行半定量分析。陽性細胞著色百分比率記A：<5%，0分;5%～25%，1分;26%～50%，2分;>50%，3分;陽性細胞著色強度記B：無染色或只有淡黃的背景染色，0分;淡黃色細胞膜或細胞漿染色，1分;黃色細胞膜或細胞漿染色，2分;棕褐色細胞膜或細胞漿染色，3分。積分=A×B。積分0分（-）;積分1～3分（+）;積分4～6分（++）;積分7～9分（+++）。每組實驗均由兩位病理主治以上診斷醫生顯微鏡下判讀，最后取檢測結果的平均值作為最終的實驗結果，根據等級資料的性質進行適合的統計學分析[5-6]。

1.3 統計學方法

采用SPSS 23.0軟件包進行統計學分析，計量資料采用t檢驗，等級資料采用秩和檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 凋亡相關因子P53在胎盤滋養細胞中的表達

P53蛋白主要表達于胎盤滋養細胞細胞核，本實驗中P53在對照組與實驗組中僅見極少量的斑駁表達或不表達，表達沒有顯著差異（P>0.05），見表1，封三圖11A、11B。

2.2 bax、bcl-2在胎盤滋養細胞中的表達

bax、bcl-2在對照組與實驗組中胎盤滋養細胞中均見表達，最主要表達于合體滋養細胞的細胞膜和細胞漿中以及細胞滋養細胞的細胞膜、細胞漿中或表達于蛻膜組織中。實驗組中胎盤滋養細胞bax的表達明顯高于對照組滋養細胞，差異有統計學意義（P<0.05），見表1、封三圖12A、12B。實驗組bcl-2蛋白在滋養細胞表達低于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1、封三圖13A、13B。

3 討論

FGR是產科常見并發癥，其病因多而復雜，目前尚有一部分的FGR病因不明確。FGR不僅會引起嚴重的圍產期并發癥，對產婦造成重要影響，從長遠的意義看還可能會造成兒童智力的發育及心理健康重大影響。胎盤組織是介于胎兒和產婦之間的物質交換重要器官，胎盤的異常可能導致胎盤血液灌注不足，與之相連的是胎兒無法得到充足的營養供給，引起FGR的發生。隨著現代醫學的不斷進步和發展，從分子學機制對FGR的發生發展有了進一步認識。有研究指出FGR的胎盤中存在凋亡基因[7]。細胞的凋亡是活體組織發生的程序性的細胞死亡，正常病理生理過程及個體成熟發育都必不可少的一種分子生物學現象[8]。本實驗組前期研究發現FGR胎盤存在凋亡增加，可能導致胎盤正常功能失衡引起FGR。細胞凋亡是多因素的共同調節使細胞凋亡得以程序性的進行，維持機體的正常功能[9]。影響FGR胎盤凋亡的相關調控因子主要有哪些是本實驗的研究重點，這些凋亡因子在FGR胎盤凋亡發生中有什么影響，值得我們進一步深入探討和研究。

Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡中起著重要作用，是一類新的癌基因家族[10]，分為二類，其一主要功能是抑制凋亡，代表基因為bcl-2，它的生理功能是抑制細胞凋亡，延長細胞的壽命，而不影響細胞的周期和分化[11]。另一類主要功能為促進細胞凋亡，代表基因為bax，bax可以自身形成同源二聚體或與bcl-2形成異源二聚體，共同參與細胞凋亡，是細胞凋亡的主要結構基礎[12]。Bcl-2和bax蛋白在細胞凋亡中的作用相反，通常是以二聚體形式保持一個動態平衡發揮正常作用，當兩組蛋白表達失衡，會形成同源二聚體如bax/bax同源二聚體，或bcl-2/bcl-2同源二聚體，bax/bax同源二聚體數量增多導致細胞過度凋亡，影響組織正常生理功能，bcl-2/bcl-2同源二聚體數量增多，抑制細胞凋亡，導致正常凋亡失衡，同樣也可以引起組織功能異常。有研究表明，Bcl-2胎盤細胞滋養細胞中低表達，而在合體滋養細胞中高表達，在妊娠的早、中、晚期表達也不一樣[13]。在正常妊娠過程中，凋亡持續存在，妊娠早期以抑制細胞凋亡，增加細胞增殖為主，妊娠晚期以細胞凋亡增加為主，在這個過程中凋亡因子發生著變化維持胎盤的動態平衡，參與細胞凋亡的過程。經本課題組研究證實，在正常妊娠晚期（對照組）、FGR患者胎盤（實驗組）均可見滋養細胞凋亡，FGR（實驗組）滋養細胞凋亡明顯增加。Bcl-2和bax蛋白在FGR發生異常凋亡中是否起著一定的作用，如果有作用，它們是如何調控FGR胎盤滋養細胞高凋亡現象是本實驗關注的主要問題。