P物質和降鈣素基因相關肽及炎癥因子在非糜爛性食管炎發生中的作用研究

杜秀云 賽米·賽麥提 趙新勝 李贊林 李義亮

前 言

非糜爛性反流病（non?erosive reflux disease，NERD）是胃食管反流病（gastroesoghageal reflux disease，GERD）當中最常見的類型，在GERD的發病率中占約70%；且其發病率呈逐年上升趨勢，嚴重影響患者的生活質量，并對公共衛生事業提出了嚴峻挑戰[1?3]。研究發現，NERD發病的重要病理生理機制與食管內臟高敏感（viceral hypersensitivity，VH）相關，且目前其治療依賴于質子泵抑制劑。但對部分NERD患者反流癥狀療效不佳，推測VH是NERD患者質子泵抑制劑療效差的重要原因之一[4]。神經肽類物質如P物質（substance P，SP）和降鈣素基因相關肽（calcitonin gene?related peptide，CGRP）在NERD患者食管黏膜表達明顯增加，且與疼痛感覺閾值呈明顯負相關，推測SP和CGRP可能共同參與了NERD VH的外周機制[5]。

據研究報道，SP及白細胞介素?6（Interleukin?6，IL?6）的釋放有促炎性作用而使神經興奮性增高引起感覺過敏，進而形成神經源性炎癥，該現象被稱為傳人神經的傳出功能，其可能是SP參與NERD食管VH性形成的重要機制之一[6]。近年來，研究神經肽與NERD VH的相互關系成為熱點。本課題通過研究NERD患者和健康受試者食管粘膜層和血液中SP、CGRP的表達情況以及炎癥因子表達及分布情況，探討SP、CGRP以及炎癥因子在NERD發生發展中的作用。

資料與方法

一、一般資料

收集2018年10月至2019年4月間在新疆維吾爾自治區人民醫院住院就診的NERD患者25例和健康受試者10例。所有研究對象中：男性22例（68%），女性13例（32%），正常對照組和NERD組年齡平均數分別為29.52歲和33.65歲。所有研究對象均進行GerdQ問卷調查、24 h食管pH監測、上消化道內鏡等檢查。本研究經新疆維吾爾自治區人民醫院住院倫理委員會批準，患者及家屬對本研究的目的及意義均充分知情，且簽署了知情同意書。

二、納入與排除標準

1.納入標準：（1）年齡18～65歲；（2）存在典型的胃食管反流癥狀，并至少持續3個月以上，或合并有食管外表現；（3）胃鏡檢查陰性；（4）質子泵抑制劑試驗陽性；（5）知情同意者。

2.排除標準：（1）內鏡下胃、十二指腸潰瘍（無論活動期或靜止期），糜爛性十二指腸炎；（2）內鏡下消化道腫瘤；（3）有上消化道手術史；（4）知情不同意者。

三、檢測指標

1.食道測酸：應用24 h食管pH監測GERD嚴重程度是應用電極檢測患者24 h食管pH，遠端電極置于食管下括約肌線上20 cm，近端電極置于食管下括約肌線上5 cm，測定患者24 h pH＜4的總百分時間（總酸暴露時間），pH＜4的次數（酸暴露頻率），持續5 min以上的反流次數和最長反流時間，分析DeMeester評分，評價GERD嚴重程度。

2.食管測壓：運用高分辨率食管測壓分析食管下段括約肌（lower esopheagel sphincter，LES）長度、LES靜息壓、LES殘余壓、收縮前沿速度、食團內部壓力及食管遠端收縮積分等指標。

四、組織標本處理

要求各組患者簽署知情同意文件，收集各組患者食管粘膜組織標本，置于-80℃冰箱備用。同步采集病人的清晨空腹血液3 ml，離心取血清，置于-20℃或-80℃冰箱備用。

五、組織病理學檢查

食管組織標本4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片行H&E染色。

六、定量反轉錄聚合酶鏈反應（Reverse Transcription?Polymerase Chain Reaction，RT?PCR）

采用實時定量RT?PCR方法檢測SP、CGRP、白細胞介素?1β（Interleukin?6，IL?1β）、IL?6、干擾素?α（Interferon?α，IFN?α）、及腫瘤壞死因子?α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）的表達。每例組織標本置于TRIzol試劑（LIFE公司生產）提取總RNA，采用Fast Quant RT試劑盒（Foregene公司生產）合成第一鏈cDNA。由上海生工生物工程股份有限公司設計并合成引物，各指標及GAPDH引物序列和擴增產物長度見表1。RT?PCR反應嚴格按照試劑盒操作說明進行。實時定量RT?PCR，反應體系為20 μL，反應條件為95℃2 min，然后95℃20 s，60℃20 s，72℃20 s，共40循環。采用2—△△CT計算出各組目標基因的相對表達倍數。

表1 定量RT?PCR引物序列及產物長度

七、統計分析

應用SPSS21.0軟件進行數據處理。計量資料使用均數±標準差（±s）表示。兩組間計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗，兩組間計數資料比較采用方差分析及χ2檢驗，相關分析采用Pearson相關分析。以P＜0.05為具有統計學意義。

結 果

一、本研究病例的一般情況

經過對研究對象的臨床表現，GERDQ評分及內鏡檢查，研究對象分為NERD組和正常對照組。表2表示，性別、年齡以及體質量指數（Body mass index，BMI）等一般情況在兩組間差異無統計學意義（χ2=1.232，P＞0.05）、（t=2.143，4.895；P＞0.05）。

表2 各組患者一般情況的比較

二、食管酸反流分析結果

如表3所示，食管24 h pH監測結果顯示，NERD組患者弱酸反流（4＜pH＜7）次數、酸反流（pH≤4）次數、食管近端酸反流及DeMeester評分等指標明顯高于對照組，兩組間具有統計學意義（P＜0.05）。

表3 兩組GERD患者24 h食管酸反流的比較

三、高分辨率食管測壓

食道高分辨率觀測結果顯示，NERD組和對照組食管下段括約肌LES長度、LES靜息壓、LES殘余壓、收縮前沿速度、食團內部壓力及食管遠端收縮積分等指標比較，差異無統計學意義（P＞0.05，見表4）。

表4 NERD組和對照組食管動力學比較

四、組織學特點

鏡下觀察發現，對照組粘膜組織形態基本完整，未見水腫或免疫細胞的浸潤。NERD組食管黏膜可見中性粒細胞（以箭頭所示）的浸潤和炎癥前反應（圖1A）。組織炎癥評分顯示（圖1B），NERD組食管粘膜的炎癥損傷評分明顯高于對照組，P值0.003，兩組間具有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 兩組食管粘膜組織H&E染色及炎癥評分比較A示兩組食管組織H&E染色（10×40）；B示兩組食管炎癥評分比較；**P＜0.01 vs對照組

五、食管粘膜SP和CGRP表達的結果

兩組食管粘膜組織RT?PCR實驗結果顯示，NERD組SP及CGRP的mRNA相對表達量與對照組相比顯著上升，P值分別為0.0046，0.002，并具有統計學意義（P＜0.01）。

六、食管粘膜炎癥因子

IL?1β、IL?6、IFN?γ、TNF?α等炎癥因子指標的RT?PCR實驗結果顯示，NERD組食管粘膜中，IL?1β、IL?6、IFN?γ以及TNF?α的mRNA相對表達量明顯增高，P值分別為0.0034，0.0043，0.004，0.0028，兩組間比較具有明顯地統計學意義（P＜0.01）。

圖2 兩組食管粘膜組織SP及CGRP的mRNA表達**P＜0.01 vs對照組

七、相關性分析

通過Pearson相關性分析發現，NERD組酸反流評分（DeMeester）分別與SP、CGRP及炎癥因子（IL?1β、IL?6、IFN?γ、TNF?α）的mRNA表達之間有強相關性，P值分別為0.003，0.000，0.002，0.005，0.004，0.000，具有統計學意義（P＜0.01），相關系數（r）分別為0.96、0.95、0.91、0.98。

圖3 兩食管粘膜組織炎癥因子的mRNA表達**P＜0.01 vs對照組

討 論

NERD患者典型的燒心、反流、胸痛癥狀和其內鏡下觀察食管黏膜病變陰性的特征，表明了在既往已知的GERD發病機制，如抗返流屏障功能降低、食管清除功能障礙、胃排空延遲之外另有他因[7]。近年來，隨著對NERD研究的不斷發展，VH在NERD發病機制中的作用逐漸被重視，被認為是可以解釋產生燒心的病理生理機制和致使食管黏膜VH相關的神經肽（如SP、CGRP）也漸漸成為國內外研究的熱點[8]。有研究證實，神經肽類物質SP、CGRP引起VH的過程中，食管黏膜中炎癥因子出現了高表達的現象[9]。

GERD癥狀的產生除了與反流物的酸性程度及其量有關外，還可能與食管VH的產生有關。食管VH的產生機制尚不明確，可能與多種離子通道或相關受體表達的變化有關[10]。瞬時電位香草酸亞型1和蛋白酶激活受體2（Protease?activated receptor，PAR?2）作為兩種重要的酸敏感受體，可能與食管VH的產生有關[11]。研究組的前期實驗結果表明，不同亞型GERD患者食管組織中瞬時電位香草酸亞型1和PAR?2陽性細胞表達均明顯強于正常組，且其mRNA的表達水平在GERD組患者中呈高表達，并由瞬時電位香草酸亞型1和PAR?2介導的VH產生機制中，PAR?2可能處于主導作用[12?15]。

研究發現，在功能性消化不良疾病的研究中提出CGRP和SP參與消化道VH發病機制[16]。CGRP和SP是食管痛覺產生及傳導的兩種重要物質，CGRP可以抑制與SP降解有關的內肽酶，使SP的作用增加或延長，兩者在疼痛信息傳遞中可能存在協同作用[17]。高云等[18]通過測定NERD組及健康對照組血清CGRP和SP的含量并與GerdQ評分進行相關分析，發現NERD患者血清CGRP和SP表達水平明顯高于正常對照組；且CGRP和SP表達與GerdQ評分呈正相關。因此，推測CGRP和SP可能在NERD VH的發病機制起重要作用。本研究，通過對NERD和正常組之間食管黏膜CGRP和SP含量對比分析的研究發現，NERD患者食管黏膜中CGRP和SP的含量和正常人組相比差異有統計學意義。因此，我們有理由推測CGRP和SP在食管黏膜中的過度表達可能和NERD患者VH有關。

CGRP和SP通過炎癥反應參與到VH的過程中，食管黏膜末梢神經接受化學物質或機械擴張刺激后，CGRP和SP在食管黏膜中的過度表達，同時伴隨著炎癥因子的大量堆積，引起局部炎癥反應[19]。有研究發現，NERD患者在食管黏膜中和血清中的炎癥因子IL?1β、IL?6、IL?8和TNF?α水平、炎癥密切相關的PAR?2、環氧合酶?2均明顯高于正常人組[20]。本研究結果顯示，與正常對照組相比，NERD患者食管下段粘膜組織中SP、CGRP及促炎因子（IL?1β、IL?6、IFN?γ以及TNF?α）的mRNA表達水平顯著上升，并且與酸反流評分（DeMeester）存在正相關關系。這可能是酸反流可直接激活食管組織中神經肽類物質和炎癥因子，從而引起VH和炎癥的作用機制。至于神經肽物質、炎癥因子、VH性之間的如何互相影響并最終導致NERD的發生發展，仍需要進一步實驗研究加以證實。

綜上所述，疼痛感覺的產生需要神經末梢感受器感受到相關物理或化學刺激產生神經信號，途徑各級神經突觸傳導到大腦中樞神經處理相關刺激信號并作出疼痛感應。所有參與信號傳導的各個環節均有可能影響NERD患者常見燒心的感覺。臨床研究同樣證實了NERD和焦慮之間有明顯的關聯，已經證明，焦慮和抑郁的程度越高，酸抑制療法的效果越差，因此，心理因素可以用作抗返流治療的預測指標。[39?41]因此未來的相關研究需把精神因素考慮作為相關指標十分必要。NERD和精神疾病互為因果的關系商不得而知，但這些研究提醒我們中樞神經的異常亦有可能影響相關癥狀的產生，例如Martinez等研究提到的與反流無關的患者，其癥狀與胃酸反流無關，但與其它形式的反流或心理因素有關，約占NERD患者的32.0%。同樣有研究指出，在大腦皮層層面或是脊髓神經亦或是周圍末梢神經層面的病變，均有可能影響或引起內臟高敏感性。鑒于實驗的倫理道德，目前絕大部分研究關注點都只在食管黏膜的病變，尚未有涉及從感受器傳入神經再到中樞神經整條反應線路的研究，因此NERD發病機制的探索注定艱辛曲折。但即便是一小步的探索發現，亦有可能為眾多對PPI治療無效的NERD患者提供新的藥物研發思路。本次研究可能具有重大的臨床意義，在臨床實踐中我們應更加注意內臟高敏感性，尤其是對于酸抑制療法反應較差的患者。此外，應研究新的NERD治療方法，這些藥物可以靶向刺激知覺鏈的每個組成部分，包括神經遞質的新激動劑/拮抗劑，例如被SP激活的CGRP受體。能夠降低超敏反應的藥物可能具有治療功能性疾病（如NERD）的潛力。