CDC14B在小鼠1-細(xì)胞期受精卵各細(xì)胞周期的動態(tài)表達(dá)及其定位

劉嵐清，李瑞林，周曉敏，孟 峻

( 1．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059 ；2．內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050 )

細(xì)胞分裂周期蛋白14B(cell division cycle 14B,CDC14B)廣泛參與細(xì)胞減數(shù)分裂、有絲分裂、胞質(zhì)分裂、中心體復(fù)制、維持紡錘體穩(wěn)定性、G2期損傷檢查點(diǎn)激活、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞癌變和纖毛形成等生理病理過程[1-2]。CDC14B是一種高度保守的雙特異性磷酸酶，通過使靶蛋白的絲氨酸和蘇氨酸去磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)靶蛋白的生物學(xué)活性[3]。POWERS等[4]研究表明：在鼠卵母細(xì)胞發(fā)生減數(shù)分裂時，過表達(dá)的CDC14B可減慢卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，甚至導(dǎo)致卵母細(xì)胞停止發(fā)育，而缺乏CDC14B的表達(dá)會促進(jìn)減數(shù)分裂的恢復(fù)。研究[5-6]表明：CDC14B在MⅠ-MⅡ期定位在紡錘體，可通過調(diào)節(jié)E-鈣黏蛋1(cadherin,CDH1)和降解細(xì)胞周期素B1(cyclin B1,CCNB1)的表達(dá)，減少CCNB1與細(xì)胞周期依賴性激酶CDK1的結(jié)合，對抗CDC2活性，從而阻滯鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的恢復(fù)，表明CDC14B可能是減數(shù)分裂的負(fù)性調(diào)控因子。對人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的研究[7]表明:CDC14B在間期定位于細(xì)胞核中，在后期聚集到紡錘體中央?yún)^(qū)，沉默CDC14B會引起染色體分離錯誤，多極紡錘軸的形成，表明CDC14B具有捆綁和穩(wěn)定微管的功能。在對U2OS的研究[8]中發(fā)現(xiàn)：CDC14B通過激活細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶1(checkpoint kinase 1,Chk1)，激活DNA修復(fù)通路，修復(fù)損傷的DNA。另有學(xué)者[9-13]發(fā)現(xiàn)：下調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中CDC14B的表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞DNA修復(fù)能力缺陷，人類喉癌組織中CDC14B表達(dá)增強(qiáng),宮頸癌中CDC14B基因的5-羥甲基胞嘧啶高于5-甲基胞嘧啶,特殊類型的甲狀腺髓樣癌中CDC14B明顯失活。此外，還有研究者[14-15]發(fā)現(xiàn)：CDC14B突變的鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)會提前表現(xiàn)出衰老狀態(tài)，DNA損傷情況較為嚴(yán)重，也表明CDC14B具有DNA損傷修復(fù)作用。以上研究充分說明CDC14B在細(xì)胞分裂過程中具有重要的生物學(xué)作用，有重要的研究價值。但關(guān)于小鼠1-細(xì)胞期受精卵中是否存在CDC14B及其在有絲裂分裂中的調(diào)控作用尚不清楚，其是否也定位于紡錘體進(jìn)而調(diào)控紡錘體的功能，目前國內(nèi)外尚未見報道。本研究以小鼠1-細(xì)胞期受精卵為研究對象，主要研究CDC14B在小鼠不同細(xì)胞周期1-細(xì)胞期受精卵中的表達(dá)和定位，為研究CDC14B在小鼠受精卵G2/M期轉(zhuǎn)換中的作用機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器昆明系SPF級小鼠由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蒙)2016-0001。雌鼠4～6周，體質(zhì)量18～20 g；雄鼠8周齡以上，體質(zhì)量25～30 g。fast200 RNA提取試劑盒(上海飛捷生物技術(shù)有限公司)，CDC14B抗體、β-Actin抗體和β微管蛋白(β-tubulin)抗體(美國Santa Cruz公司)，MB培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，M16培養(yǎng)液、礦物油和透明質(zhì)酸酶(美國Sigma公司)，孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素(hCG)(赤峰博恩藥業(yè)有限公司),Hoechst33258和細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)公司)，Alexa Fluor 594 標(biāo)記的驢抗兔IgG(H+L)和Alexa Fluor 488 標(biāo)記的驢抗山羊IgG(H+L)(美國Jackson Immuno Research公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Piece Biotechnology 公司)，預(yù)染蛋白Marker(立陶宛MBI公司提供)，RNA PCR(AMV)ver3.0試劑盒(日本TaKaRa公司)，TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒(北京全式金公司)。35 mm和60 mm培養(yǎng)皿(丹麥Nunc公司)，高速微量冷凍離心機(jī)(5427R)和生物安全柜(1300系列Ⅱ級A2型)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，萬分之一電子天平(110S) (德國Sartorius公司 )，CO2培養(yǎng)箱(CB115) (德國WTB-binder公司)，純水機(jī)(JCHRO-40Z)(北京捷創(chuàng)偉業(yè)環(huán)保設(shè)備公司)，恒溫培養(yǎng)箱(江蘇省宏華儀器廠)，渦旋混合器(海門市其林貝爾儀器制造公司)，臺式高速離心機(jī)(LG16-WA)(北京京立離心機(jī)有限公司)，實(shí)時熒光定量PCR儀和電泳槽0.75ram垂直板(美國Bio-Tad公司)，激光共聚焦掃描顯微鏡(德國Leica公司)，相差顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，

1.2 小鼠受精卵的采集和培養(yǎng)4～6周的成熟雌性小鼠10只，在明暗交替、溫度適宜的環(huán)境中喂養(yǎng)4～6 d。將腹腔注射當(dāng)日作為第1天，于中午12:00每只雌性小鼠腹腔內(nèi)注射孕馬血清10 IU，于第3天中午12:00每只雌性小鼠腹腔內(nèi)注射hCG 10 IU。在注射hCG后，將雄性小鼠和雌性小鼠合籠過夜。至次日早晨分別檢查與雄鼠合籠過夜的每只雌性小鼠的陰栓，雌性小鼠有陰栓則表明已經(jīng)成功交配。將雌性小鼠脫頸處死解剖，取出兩側(cè)卵巢，放入備有生理鹽水滴的培養(yǎng)皿上，在體視顯微鏡下撕開輸卵管壺腹部膨大處，流出受精卵細(xì)胞團(tuán)，吸入溶有透明質(zhì)酸酶 (0.3 g·L-1)的M2培養(yǎng)液中，清洗受精卵細(xì)胞團(tuán)，去除顆粒細(xì)胞，再用M16培養(yǎng)液清洗2～3次，直到無顆粒細(xì)胞為止。清洗完成后，將G1期受精卵移入M16培養(yǎng)液中，覆蓋一層礦物油，于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2和飽和濕度。

不同細(xì)胞周期1-細(xì)胞期受精卵的收集主要根據(jù)受精卵細(xì)胞的形態(tài)和hCG注射后的時間，分別收集G1、S、G2和M期4個階段的受精卵。G1期受精卵：在注射hCG后19～20 h收集G1期受精卵，此時卵細(xì)胞中雄雌原核的距離較遠(yuǎn)，雄原核較雌原核稍微大一些；S期受精卵：在注射hCG后23～24 h收集S期受精卵，此時雄雌原核的體積漸漸增大并靠近，核仁已經(jīng)出現(xiàn)；G2期受精卵：在注射hCG后27～28 h收集G2期受精卵，此時雌雄原核的輪廓慢慢消失，胞漿呈粗大顆粒狀，細(xì)胞膜邊緣開始出現(xiàn)凹陷；M期受精卵：在注射hCG后30 h收集M期受精卵，此時出現(xiàn)胞質(zhì)分裂，受精卵胞體拉長，染色體分散到兩極。

1.3 RT-PCR法檢測1-細(xì)胞期受精卵中CDC14B mRNA表達(dá)水平將收集到的每組100個1-細(xì)胞期受精卵按 fast200試劑盒操作步驟提取RNA,用微量紫外分光光度計在波長280 nm和260 nm處測定2 μL所提 mRNA的吸光度(A)值，計算A(260)/A(280)的比值，若比值為1.8～2.0，說明純度較高，所提取的mRNA可以進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。采用RNA PCR(AMV)ver3.0試劑盒按操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為10 μL。反 轉(zhuǎn) 錄 條 件：42℃、30 min，99℃、5 min，4℃、5 min，1個循環(huán)。采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix試劑盒進(jìn)行RT-PCR,PCR引物由日本TaKaRa公司設(shè)計，引物序列：CDC14B(NM_001122989.1)，5′-ATGACCTGTCCTTAAATGGGCTTG-3′和 5′-TTCAGGGCCCGAAGT-

CTGTC-3′；β-actin(NM_007393)，5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′和5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′。PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性30 s，94℃、 5 s，60℃、 15 s，45個循環(huán)；95℃、15 s，56℃、30 s，95℃、15 s，1個循環(huán)。采用2-ΔΔct法計算CDC14B mRNA表達(dá)水平。

1.4 Western blotting法檢測1-細(xì)胞期受精卵中CDC14B蛋白表達(dá)水平分別收集G1、S、G2和M 期4個時期的小鼠1-細(xì)胞期受精卵各200個，從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到1.5 mL Eppendof管中，4℃、3 000 r·min-1離心10 min，盡量去除培養(yǎng)液，加入適量緩沖液(20 mmol·L-1Tris-Hcl，pH 7.5，2 mmol·L-1EDTA，0.25 mmol·L-1Glucose，10 mmol·L-1EGTA)，充分振蕩混勻，然后經(jīng)3～4次凍融循環(huán)，使所有受精卵完全裂解，-20℃保存?zhèn)溆谩＜尤脒m量SDS緩沖液，100℃煮沸5 min使蛋白變性，加入電泳液后開始準(zhǔn)備上樣，SDS-PAGE電泳分離。將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，將膜用TBS浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上封閉1 h。與CDC14B抗體(稀釋比為1∶100)和β-actin抗體(稀釋比為1∶500) 4℃孵育過夜，在室溫下脫色搖床上洗滌3次。將HRP偶聯(lián)的兔抗羊IgG或羊抗兔IgG用TBST溶液室溫下孵育2 h，在室溫下脫色搖床上洗滌3次，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像，以CDC14B條帶的灰度值與β-actin條帶的灰度值比值代表蛋白表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞免疫熒光法檢測CDC14B和β-tubulin在小鼠1-細(xì)胞期受精卵中各期的亞細(xì)胞共定位將培養(yǎng)得到的G1、S、G2和M期受精卵分別用PBS(含1%BSA)洗滌3次，然后用4%多聚甲醛室溫固定1 h， PBST溶液(PBS加入0.01%Tween20)洗滌3次，0.1%Triton X-100(溶解于PBS)打孔30 min。用含5%BSA的PBS封閉液封閉1 h，將上述處理好的受精卵轉(zhuǎn)入一抗即CDC14B和β-tubulin抗體，與封閉液按1∶500稀釋，室溫2 h，洗液洗滌3次后將受精卵轉(zhuǎn)入二抗(Alexa Fluor 594 標(biāo)記的驢抗兔IgG和Alexa Fluor 488標(biāo)記的驢抗山羊IgG,按1∶50稀釋)中，孵育條件為室溫、避光1 h，洗滌3次，再用Hoechst33258染色10 min，使核酸染色，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察CDC14B和β-tubulin在受精卵中的定位及核酸染色情況。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠不同細(xì)胞周期1-細(xì)胞期受精卵中CDC14B mRNA表達(dá)水平RT-PCR結(jié)果顯示：小鼠不同細(xì)胞周期1-細(xì)胞期受精卵中均有CDC14B mRNA表達(dá)，G1、S、G2和M期1-細(xì)胞期受精卵中CDC14B mRNA表達(dá)水平分別為1.00±0.06、1.17±0.03、2.59±0.05和1.75±0.01，與G1期比較，S、G2和M期1-細(xì)胞期受精卵中CDC14B mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

*P<0.05，**P<0.01 compared with G1 phase.

2.2 小鼠不同細(xì)胞周期1-細(xì)胞期受精卵中CDC14B蛋白表達(dá)水平Western blotting法檢測結(jié)果顯示：小鼠不同細(xì)胞周期1-細(xì)胞期受精卵中均有CDC14B蛋白表達(dá)，其表達(dá)規(guī)律與其mRNA表達(dá)規(guī)律相符。CDC14B蛋白從G1期開始表達(dá)(0.50±0.02)，S期其表達(dá)水平 (0.57±0.03)升高，高表達(dá)持續(xù)到G2期(0.90±0.02)，M期CDC14B蛋白表達(dá)水平(0.71±0.05)降低。與G1期比較，S、G2和M期的1-細(xì)胞期受精卵中CDC14B蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

Lane 1:G1 phase; Lane 2:S phase; Lane 3:G2 phase; Lane 4:M phase.*P<0.05，**P<0.01 compared with G1 phase.

2.3 CDC14B和β-tubulin在小鼠不同細(xì)胞周期1-細(xì)胞期受精卵中的共定位細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在小鼠1-細(xì)胞期受精卵中，CDC14B(紅色熒光)和β-tubulin(綠色熒光)在G1期和S期共定位于小鼠受精卵皮質(zhì)；在G2早期，CDC14B和β-tubulin共定位于細(xì)胞質(zhì)；在G2晚期，部分CDC14B入核；在M期，CDC14B和β-tubulin共定位于紡錘體。見圖3 (插頁一)。

3 討 論

1970年，HARTWELL通過對出芽酵母的研究首次發(fā)現(xiàn)CDC14，并將其定義為有絲分裂退出因子[16]。CDC14B作為一種絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，可使細(xì)胞周期依賴性激酶的多種底物去磷酸化，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)多種生理病理過程[17-20]，而CDC14B在小鼠受精卵早期發(fā)育過程中的表達(dá)及定位目前尚未見報道。本研究結(jié)果表明：小鼠G1、S、G2和M 4個時期1-細(xì)胞期受精卵中CDC14B mRNA 均有表達(dá)，在G2期其表達(dá)水平最高，至M期下降，且其蛋白表達(dá)規(guī)律與mRNA表達(dá)規(guī)律相符，G2/M期的過渡是細(xì)胞發(fā)育、生長和增殖的重要時期，與G1期比較，G2和M期1-細(xì)胞期受精卵中CDC14B的表達(dá)水平均明顯升高，表明CDC14B可能調(diào)控小鼠1-細(xì)胞期受精卵G2/M期的轉(zhuǎn)換。

蛋白定位與其功能密切聯(lián)系，本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞免疫熒光證實(shí)：在小鼠1-細(xì)胞期受精卵中，G1和S期CDC14B與β-tubulin共定位于受精卵皮質(zhì)，G2期CDC14B與β-tubulin共定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，M期CDC14B與紡錘體共定位。在小鼠卵母細(xì)胞中，CDC14B與紡錘體共定位，可通過調(diào)節(jié)紡錘體的功能進(jìn)而調(diào)節(jié)減數(shù)分裂。在本研究中，小鼠受精卵細(xì)胞與微管蛋白β-tubulin也共定位，表明CDC14B可能參與調(diào)控紡錘體的功能。CDC14B是一種重要的蛋白磷酸酶，具有廣泛的研究前景，本課題組接下來的研究就是通過構(gòu)建CDC14B的表達(dá)質(zhì)粒，過表達(dá)或沉默CDC14B，觀察過表達(dá)和敲減的CDC14B對小鼠受精卵生長發(fā)育的影響，探討CDC14B在受精卵G2/M期轉(zhuǎn)換中是否具有調(diào)控作用，再進(jìn)一步研究CDC14B蛋白直接作用的相關(guān)靶蛋白，與靶蛋白的相互作用及具體作用位點(diǎn)，為癌癥的診斷和治療開辟一條新的途徑。對具有天然細(xì)胞周期模型的小鼠受精卵的研究，將有利于揭示哺乳動物生殖發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，更全面地認(rèn)識細(xì)胞生長、發(fā)育、癌變和凋亡的內(nèi)在機(jī)制，對動物繁殖、人類生殖輔助技術(shù)和腫瘤的靶向治療具有重要的社會實(shí)用價值。