抑瘤素M對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響

孔 寧，周余來，張 璐, 石 毅，石 艷，孫忠平，鄒穎剛

(1. 吉林大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)用生物材料學(xué)教研室，吉林 長春130021；2. 吉林省中科生物工程股份有限公司，吉林 長春 130012；3. 吉林大學(xué)藥學(xué)院生物工程實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長春130021；4. 吉林大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)藥理與毒理學(xué)教研室，吉林 長春130021；5. 吉林大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心，吉林 長春130041)

近年來骨組織工程與再生醫(yī)學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，為解決傳統(tǒng)植骨術(shù)后骨形成緩慢和新骨形成不良等技術(shù)難點(diǎn)提供了一種有效解決途徑，其中種子細(xì)胞的來源、調(diào)控種子細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)劑是其關(guān)鍵所在[1]。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)取材于分娩廢棄物的臍帶組織，hUCMSCs在體外具有多向分化潛能，可成為各種組織的種子細(xì)胞。hUCMSCs不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)-Ⅱ類抗原，表達(dá)MHC-Ⅰ類抗原，不表達(dá)或低表達(dá)移植免疫排斥相關(guān)的共刺激因子CD80、CD86、CD40和CD40L等，是一類免疫缺陷細(xì)胞[2]。hUCMSCs具有很強(qiáng)的免疫抑制能力，包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞及DC等，在多方面被證明是自體和異體細(xì)胞移植治療的理想細(xì)胞。與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)比較，hUCMSCs在增殖和誘導(dǎo)分化能力方面更具潛能[3]。抑瘤素M(oncostatin M，OSM)是一種多功能的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)基因活性、細(xì)胞存活、增殖和分化的功能[4]。OSM對調(diào)節(jié)骨發(fā)育和重塑至關(guān)重要，基因敲除或轉(zhuǎn)基因小鼠研究[5]證明OSM對于小鼠正常骨發(fā)育和骨轉(zhuǎn)換是必不可少的。過表達(dá)OSM的轉(zhuǎn)基因小鼠能促進(jìn)骨質(zhì)疏松組織的發(fā)育，可能是通過刺激骨形成并抑制骨吸收所致。成骨分化模型的體外研究[6]表明：OSM能刺激BMSCs的成骨分化、抑制成脂分化。目前OSM對hUCMSCs是否具有成骨分化作用尚未見相關(guān)報(bào)道。本課題組前期應(yīng)用基因工程技術(shù)已制備出足量、高活性、高純度的重組人抑瘤素M(recombinant human OSM，rhOSM)[7-8]，本研究進(jìn)一步探討rhOSM對hUCMSCs增殖及分化的影響，觀察OSM能否促進(jìn)hUCMSCs定向成骨分化，旨在明確OSM是否為一種良好的成骨誘導(dǎo)活性因子。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器hUCMSCs由吉林省中科生物工程股份有限公司惠贈(zèng)。rhOSM由吉林大學(xué)藥學(xué)院醫(yī)用生物材料教研室制備并保存。胎牛血清、DMEM/F-12培養(yǎng)基、胰蛋白酶和細(xì)胞凍存液(美國Gibco公司)，地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸和氯化十六烷基吡啶(美國Sigma公司)，TRIzol和反轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)，骨鈣素(osteocalcin，OCN)抗體、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)抗體和GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)流式檢測試劑盒(美國BD公司)，CCK-8試劑盒和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，ALP)顯色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，ALP檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)，茜素紅鈣染色試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。CO2恒溫孵箱(日本Sanyo公司)，核酸蛋白定量檢測儀和高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)利用添加終濃度為10%胎牛血清的DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基對hUCMSCs進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至80%融合時(shí)傳代。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定hUCMSCs免疫表型收集第3代處于對數(shù)生長期的hUCMSCs ，制成單細(xì)胞懸液。分別加入抗人 CD90、CD73、CD105、CD34、CD45、CD11b、CD19C和HLA-DR 單克隆抗體，4℃避光孵育30 min，將細(xì)胞重懸后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型分子陽性率，根據(jù)MSC標(biāo)準(zhǔn)鑒定hUCMSCs。

1.4 CCK-8法檢測hUCMSCs的增殖活性取第3代hUCMSCs，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞分為對照組和不同劑量(終濃度分別為0.1、1.0和10.0 μg·L-1)rhOSM組，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。放入孵箱中連續(xù)培養(yǎng)96 h，每24 h取出1塊培養(yǎng)板加入10 μL CCK-8溶液，37℃避光孵育4 h后在450 nm波長處檢測各孔吸光度(A)值，以A(450)值的平均值表示hUCMSCs增殖活性。

1.5 hUCMSCs成骨分化誘導(dǎo)培養(yǎng)取第3代hUCMSCs以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后更換為含不同劑量rhOSM的成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次。分為對照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)、經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+100 nmol·L-1地塞米松+10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉+50 mg·L-1抗壞血酸)和不同劑量rhOSM組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑+0.1、1.0和10.0 μg·L-1rhOSM)。

1.6 BCIP/NBT法進(jìn)行ALP染色和ALP活性檢測成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，吸去培養(yǎng)板里的培養(yǎng)液，洗滌細(xì)胞表面，每孔加入固定液固定2 min，加入染色液室溫避光孵育30 min，加入清理液清洗2 min，觀察并拍照，肉眼可見藍(lán)色顆粒即代表ALP有活性。分別于成骨誘導(dǎo)第4、7和14天取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液上清，用PBS緩沖液清洗2次，每孔加入200 μL 0.1% Triton X-100冰上裂解10 min，吸取上清液，用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)水平，用ALP試劑盒定量檢測ALP活性，根據(jù)說明書操作步驟，按以下公式計(jì)算ALP活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。ALP活性(U·g-1)=[測定A值-空白A值]/[標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.1 g·L-1)/待測樣品蛋白濃度( g·mL-1)。

1.7 茜素紅染色法檢測鈣結(jié)節(jié)的生成及半定量分析細(xì)胞礦化活性成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，吸棄培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗滌2次，70%冰乙醇固定1 h，2%茜素紅溶液室溫下染色10 min，吸棄染液，以雙蒸水清洗5次，PBS緩沖液晃動(dòng)漂洗15 min，干燥后顯微鏡下觀察并拍照，橘紅色沉淀即為礦化鈣結(jié)節(jié)。分別于成骨誘導(dǎo)第14和21天，取出培養(yǎng)板，茜素紅染色后，每孔加入10%氯化十六烷基吡啶溶液100 μL ，室溫放置15 min，取上清于96孔培養(yǎng)板中，562 nm波長處檢測其A值，代表細(xì)胞礦化活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測細(xì)胞中成骨分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平成骨誘導(dǎo)第4、7、14和21天，TRIzol法提取細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行擴(kuò)增，檢測成骨分化相關(guān)基因Runx2和OCN mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。PCR反應(yīng)條件：95℃、10 min；95℃、30 s，60℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。PCR引物：Runx2正向引物5′-GGACTGGGTATGGTTTGTAT-3′， Runx2反向引物5′-GCTGAAGAGGCTGTTTGA-3′；OCN正向引物5′-ACCACATCGGCTTTCAG-

G-3′， OCN反向引物5′-CATAGGGCTGGGAGGTCA-3′；GAPDH正向引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′， GAPDH反向引物5′-CGCCAGTAGACTCCACGAC-3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Runx2和OCN mRNA表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定hUCMSCs表面標(biāo)志物第3代hUCMSCs經(jīng)檢測，陽性標(biāo)志物CD90、CD105和CD73表達(dá)率分別為99.9%、99.5%和97.9%，陰性標(biāo)志物CD34、CD45、CD11b、CD19C和HLA-DR表達(dá)率為0.3%，表明所檢測的細(xì)胞表達(dá)MSC特異性抗原標(biāo)志而不表達(dá)造血干細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志，確定檢測細(xì)胞為MSC。見圖1。

A：CD90；B：CD105；C：CD73；D：CD34，CD45，CD11b，CD19C，and HLA-DR.

2.2 各組hUCMSCs增殖活性rhOSM處理hUCMSCs 24 和48 h，與對照組比較，各劑量rhOSM組hUCMSCs增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；處理72 h，與對照組比較，0.1和1.0 μg·L-1rhOSM組hUCMSCs增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，10.0 μg·L-1rhOSM組hUCMSCs增殖活性明顯降低(P<0.05)；處理96 h，與對照組比較， 各劑量rhOSM組hUCMSCs增殖活性明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且各劑量rhOSM組組間比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，具有時(shí)間-劑量依賴性。見表1。

2.3 各組細(xì)胞ALP染色情況和 ALP活性成骨誘導(dǎo)第14天，除對照組出現(xiàn)較微弱的藍(lán)色顆粒之外，其余各組均可見明顯的藍(lán)紫色顆粒，且各劑量rhOSM成骨誘導(dǎo)組細(xì)胞中藍(lán)紫色顆粒明顯多于經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組。在檢測的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，各劑量rhOSM組細(xì)胞中ALP活性明顯高于對照組(P<0.01)和經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組(P<0.05)，且隨著rhOSM劑量升高，各劑量rhOSM組ALP活性也升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。誘導(dǎo)第7天各劑量rhOSM組細(xì)胞中ALP活性較誘導(dǎo)第4天明顯升高(P<0.01)，rhOSM上調(diào)ALP活性具有時(shí)間-劑量依賴性。誘導(dǎo)第14 天， ALP活性較第7 天 有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2(插頁二)和表2。

表1 誘導(dǎo)不同時(shí)間后各組hUCMSCs增殖活性

表2 誘導(dǎo)不同時(shí)間后各組hUCMSCs的ALP活性

2.4 各組細(xì)胞礦化鈣結(jié)節(jié)形成情況和細(xì)胞礦化活性成骨誘導(dǎo)第21天，除對照組無礦化結(jié)節(jié)出現(xiàn)外，其余各組均可見桔紅色礦化結(jié)節(jié);與經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組比較，rhOSM組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量明顯增多、著色面積明顯增大且著色程度明顯增強(qiáng)。誘導(dǎo)第7、14和21天，與對照組和經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組比較，各劑量rhOSM組細(xì)胞礦化活性均明顯升高(P<0.05)；與0.1 μg·L-1rhOSM 組比較，1.0和10.0 μg·L-1rhOSM 組細(xì)胞礦化活性明顯升高(P<0.05)。rhOSM誘導(dǎo)hUCMSCs鈣鹽沉積具有時(shí)間-劑量依賴性，且rhOSM可與化學(xué)誘導(dǎo)劑產(chǎn)生協(xié)同誘導(dǎo)效應(yīng)。見圖3(插頁二)和表3。

2.5 各組細(xì)胞中Runx2和OCN mRNA表達(dá)水平成骨誘導(dǎo)第4、7和14天，與對照組比較，經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組和各劑量rhOSM組細(xì)胞中Runx2 mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；與經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組比較，各劑量rhOSM組細(xì)胞中Runx2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與0.1 μg·L-1rhOSM組比較，1.0和10.0 μg·L-1rhOSM組細(xì)胞中Runx2 mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；與誘導(dǎo)第7天比較，誘導(dǎo)第14天各劑量rhOSM組細(xì)胞中Runx2 mRNA表達(dá)水平有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

成骨誘導(dǎo)第7、14和21天，與對照組比較，經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組和各劑量rhOSM組細(xì)胞中OCN mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01)；與經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組比較，誘導(dǎo)第7天1.0和10.0 μg·L-1rhOSM組和誘導(dǎo)第14和21天各劑量rhOSM組細(xì)胞中OCN mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；誘導(dǎo)第7、14和21天，與0.1 μg·L-1rhOSM組比較，1.0和10.0 μg·L-1rhOSM組細(xì)胞中OCN mRNA表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。rhOSM誘導(dǎo)hUCMSCs成骨分化相關(guān)基因表達(dá)呈時(shí)間-劑量依賴性。見圖4和圖5。

表3 誘導(dǎo)不同時(shí)間后各組hUCMSCs的礦化活性

n=4，*P<0.01 vs control group； △P<0.05 vs classical osteogenic induction group; #P<0.05 vs 0.1 μg·L-1 rhOSM group.

n=4，*P<0.01 vs control group； △P<0.05 vs classical osteogenic induction group; #P<0.05 vs 0.1 μg·L-1 rhOSM group.

3 討 論

由外傷、腫瘤、感染或骨折治療不當(dāng)?shù)纫鸬墓侨睋p、骨折不連接在臨床上極為常見。骨骼移植是治療骨缺損和骨折不連接的必需手段。目前，新的研究思路是從成骨支架、成骨種子細(xì)胞和調(diào)控成骨分化的細(xì)胞因子三方面著手提高骨骼移植的效果。目前成骨支架多使用Ⅰ型膠原和羥基磷灰石等；成骨種子細(xì)胞問題的解決則得益于MSCs的發(fā)現(xiàn)和使用，由于MSCs具有多向分化潛能，因此尋找促進(jìn)MSCs定向成骨分化的有效的骨誘導(dǎo)活性因子是目前制約骨再生研究發(fā)展的瓶頸[9]。研究[10-12]表明：細(xì)胞因子具有明顯的促進(jìn)MSCs成骨分化的特性，如骨形態(tài)蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、堿性成纖維細(xì)胞因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)等。OSM屬于白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)家族，體外成骨模型試驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)[13]提示：該家族成員正向或反向調(diào)控成骨分化取決于細(xì)胞類型或分化階段。與OSM同為IL-6家族成員的白血病抑制因子(leukemia inhitory factor，LIF)能抑制小鼠基質(zhì)細(xì)胞的成脂分化，刺激胚胎干細(xì)胞成骨分化。小鼠關(guān)節(jié)炎模型中，腺病毒轉(zhuǎn)染的小鼠OSM(mOSM)能夠刺激小鼠骨形成[14]，應(yīng)用人OSM(hOSM)處理脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能夠提高ALP活性，并抑制成脂分化[15]，表明hOSM和mOSM均能促進(jìn)成骨分化。

本研究中CCK-8法檢測結(jié)果表明：rhOSM短期作用對hUCMSCs的增殖并無明顯影響，長期處理(>72 h)可抑制其增殖，且呈時(shí)間-劑量依賴性，提示rhOSM抑制hUCMSCs增殖的同時(shí)可能促進(jìn)其分化。ALP是鑒定成骨細(xì)胞的生化和組織學(xué)標(biāo)志，其活性在一定程度上反映成骨細(xì)胞的分化程度和功能狀態(tài)[16-17]。Runx2是成骨分化及骨形成過程中的特異性轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控成骨分化相關(guān)基因，如骨唾液酸糖蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)和OCN的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨[18]。ALP和Runx2是成骨分化早期標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示：與誘導(dǎo)第4和7天比較，誘導(dǎo)第14天各劑量rhOSM組細(xì)胞中ALP活性和Runx2 mRNA表達(dá)水平均明顯升高，呈時(shí)間-劑量依賴性，并明顯高于經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑組，表明rhOSM與化學(xué)誘導(dǎo)劑具有協(xié)同誘導(dǎo)效應(yīng)；誘導(dǎo)第14天，ALP活性和Runx2 mRNA表達(dá)水平較第7天有所降低，表明成骨分化已經(jīng)進(jìn)入礦化階段，與有關(guān)報(bào)道[19]一致。

礦化結(jié)節(jié)的形成是成骨分化的最后階段，包括膠原蛋白的沉積和基質(zhì)礦化2個(gè)步驟，是體外成骨分化的晚期標(biāo)志[20]。OCN是由成熟的成骨細(xì)胞特異合成和分泌的含量最豐富的非膠原蛋白，是反映成骨細(xì)胞活性和骨轉(zhuǎn)換狀況的特異而敏感的標(biāo)志物，對鈣和羥基磷灰石有較高的親和力[21]。本研究結(jié)果顯示：連續(xù)誘導(dǎo)21 d，各劑量rhOSM組細(xì)胞成骨礦化活性和OCN mRNA表達(dá)水平均明顯升高，表明rhOSM誘導(dǎo)hUCMSCs鈣鹽沉積呈時(shí)間-劑量依賴性，rhOSM能夠增強(qiáng)經(jīng)典成骨誘導(dǎo)劑對hUCMSCs成骨分化的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果與有關(guān)牙髓干細(xì)胞[22-23]和脂肪來源的MSCs[15]的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，本次研究初步驗(yàn)證了rhOSM不僅能夠上調(diào)成骨分化特異的轉(zhuǎn)錄因子Runx2以及成骨分化標(biāo)志物OCN的表達(dá)，還能增加成骨細(xì)胞ALP的活性和鈣鹽的沉積，表明OSM在體外能夠促進(jìn)hUCMSCs成骨分化，為骨組織工程提供了一種可選的成骨誘導(dǎo)活性因子。但MSCs成骨分化是一個(gè)復(fù)雜的和調(diào)控嚴(yán)格的過程，其過程受一系列內(nèi)源性和各種環(huán)境因子以及信號通路的影響，因此還需進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。