宮頸癌HeLa細胞外泌體對細胞遷移和侵襲的影響及其Wnt/β-catenin信號通路機制

劉 晶，王 景，葛 靜，馮艷萍，房桂英，王 旭，楊艷紅，李 林

(河北醫科大學第一醫院婦產科，河北 石家莊 050031)

宮頸癌患者治療失敗及預后比較差的主要原因為宮頸癌的轉移，但其侵襲轉移的分子機制尚不十分清楚。外泌體為一種雙層膜包裹的小囊泡，在生理和病理條件下由細胞釋放到胞外[1]。研究[2-3]顯示：外泌體攜帶包括mRNA、DNA、長鏈非編碼RNA(LncRNAs)、微小 RNA(microRNAs)、脂質和蛋白等一系列生物活性物質，在惡性腫瘤的侵襲、轉移、血管生成和化療耐藥等過程中發揮重要作用。宮頸癌細胞來源外泌體也受到大家關注，易紅艷等[4]通過差速超速離心法分離出宮頸癌Siha細胞 外泌體，并發現Siha細胞外泌體可介導癌前細胞Ect1上皮間質轉化，從而提高其侵襲能力。但宮頸癌HeLa細胞外泌體對其侵襲遷移的影響及可能機制尚未完全清楚。本文作者通過分離宮頸癌HeLa細胞外泌體，觀察其對HeLa細胞遷移、侵襲及Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)信號通路的影響，探討宮頸癌細胞來源的外泌體對宮頸癌細胞的作用和可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器人宮頸癌HeLa細胞(ATCC細胞庫)。FKH-26染劑和胰蛋白酶(美國Sigma公司)，RPMI 1640培養基和胎牛血清(美國Hyclone公司)，兔抗人CD63抗體、兔抗人CD81抗體、兔抗人Wnt1抗體、兔抗人β-catenin抗體和兔抗人T細胞因子4(T cell factor 4,TCF4)抗體(美國Abcam公司)。共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，JEM-1400透射電子顯微鏡(日本電子公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，Matrigel基質膠(美國BD公司)。

1.2 無外泌體血清制備和HeLa細胞培養將Hyclone胎牛血清100 000 g離心70 min，去除沉淀得到無外泌體胎牛血清。將HeLa細胞用無外泌體的胎牛血清配置的RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清)培養。

1.3 HeLa細胞培養上清液中外泌體的收集將對數生長的HeLa細胞用胰蛋白酶消化，用無外泌體的胎牛血清配置的RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清)培養48 h，收集HeLa細胞培養上清，500 g離心10 min，再12 000 g離心20 min，取上清液，經0.22 μm孔濾器過濾，過濾后100 000 g離心2 h，用磷酸鹽緩沖液(PBS)液重懸沉淀，100 000 g離心2 h，沉淀用PBS液重懸即為HeLa細胞外泌體，保存備用。

1.4 電鏡下觀察外泌體形態表現將上述獲得的沉淀用PBS(含2%多聚甲醛)重懸，吸取適量重懸液滴加到電鏡用銅網上，干燥30 min，PBS液清洗，加入1%戊二醛固定5 min，蒸餾水沖洗，用0.4%醋酸雙氧鈾染色5 min，醋酸雙氧鈾和甲基纖維素混合物染色并包被10 min，晾10 min，透射電鏡下拍照并觀察外泌體形態表現。

1.5 Western blottig檢測外泌體標志蛋白CD63和CD81蛋白表達情況取20 μL重懸的上述外泌體，加入蛋白裂解液10 μL，冰上裂解30 min，12 000 g離心20 min，收集上清液即為外泌體蛋白。取80 μg外泌體蛋白經電泳2 h，半干法轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入相應一抗(兔抗人CD63抗體、兔抗人CD81抗體，稀釋比例1∶1 000)，過夜孵育，以β-actin為內參。加入二抗孵育1 h，ECL顯色，暗室曝光顯影，每組設7個復孔，凝膠成像系統獲得蛋白條帶圖片，采用Image J軟件分析目標蛋白表達情況。

1.6 HeLa細胞攝取外泌體實驗PKH-26為膜標記染料，可與外泌體脂膜結合并發出紅色熒光，可用于外泌體存在的鑒定。將1 μL PKH-26染料與100 μL外泌體孵育，加入1 mL Diluent C，加入200 μL 1% BSA/PBS，再加入3 μL PKH-26染料孵育20 min，100 000 g離心70 min，獲得標記好的外泌體沉淀。將HeLa細胞置于12孔板中培養，達70%融合時更換為含標記好的外泌體的新鮮培養基孵育24 h，PBS清洗，多聚甲醛固定20 min，DAPI染色細胞核，共聚焦熒光顯微鏡下觀察HeLa細胞攝取外泌體情況。

1.7 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力用Matrigal膠包被Transwell小室上室。用無血清培養基饑餓培養HeLa細胞12 h，用胰蛋白酶消化細胞， 1 000 g離心5 min，PBS清洗，用含BSA的無血清培養基重懸HeLa細胞，調整HeLa細胞密度為1 × 105mL-1，取200 μL細胞懸液加入Transwell小室的上室，并設外泌體組(Exo組)和對照組，Exo組細胞中加入20 μL外泌體懸液，對照組細胞中加入20 μL無血清培養基，每組設7個復孔。小室的下室加入去除外泌體的培養基，培養24 h后，棉簽擦去基質膠及上室細胞，PBS沖洗，結晶紫染色，顯微鏡下觀察并計算侵襲細胞數，代表細胞遷移能力。

1.8 細胞劃痕實驗測定細胞遷移能力在12孔板背后用記號筆均勻劃3條平行橫線，橫線橫穿過孔，間隔0.8 cm。調整對數生長的HeLa細胞密度為1 × 105mL-1，在12孔板中加入HeLa細胞過夜孵育，24 h后用10 μL槍頭垂直背后橫線垂直劃痕，PBS沖洗去除劃下細胞，細胞分為Exo組和對照組，Exo組細胞總加入含外泌體懸液50 μL的無血清培養基，對照組細胞加入等量無血清培養基，置于培養箱中培養，分別于0 h和24 h拍照觀察細胞遷移距離，代表細胞遷移能力。每組設7個復孔。

1.9 Western blotting檢測細胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達水平將HeLa細胞分為Exo組和對照組，接種到培養皿中培養至細胞達80%以上融合時，更換培養基，Exo組細胞中加入含50 μL外泌體懸液的培養基，對照組加入50 μL不含外泌體的培養基培養，每組設7個復孔。24 h后提取各組細胞總蛋白，以兔抗人Wnt1、兔抗人β-catenin和兔抗人TCF4抗體為一抗，稀釋比例為1∶1 000，采用Western blotting法檢測細胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達水平，具體步驟見“1.6”。目的蛋白表達水平 = 目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

2 結 果

2.1 HeLa細胞來源外泌體鑒定透射電鏡下觀察：通過超速離心法獲得HeLa細胞培養上清中有呈圓形或橢圓形、直徑為40 ～ 100 nm的囊泡狀小體。Western blotting法檢測結果顯示：囊泡狀小體中富含CD63蛋白和CD81蛋白，表明HeLa細胞中分離的物質為外泌體。見圖1和圖2。

A: Bar = 100 nm; B: Bar = 25 nm.

2.2 HeLa細胞攝取外泌體情況HeLa細胞外泌體采用PKH26熒光標記(PKH26染劑不影響外泌體特性，且可與外泌體膜結構穩定結合發出紅色熒光)， HeLa細胞用DAPI熒光進行核染色，培養24 h，共聚焦熒光顯微鏡觀察，對照組HeLa細胞膜表面無標記外泌體附著，Exo組HeLa細胞膜表面有標記的外泌體附著。見圖3(插頁七)。

Lane 1：Control group；Lane 2：Exo group.

2.3 2組HeLa細胞中侵襲細胞數Transwell小室實驗結果顯示：與對照組比較， Exo組HeLa細胞中侵襲細胞數明顯升高(P<0.01)。見圖4和表1。

A:Cotrol group; B:Exo group.

表1 2組HeLa細胞中侵襲細胞數和遷移距離

2.4 2組HeLa細胞遷移距離與對照組比較，Exo組HeLa細胞遷移距離明顯增加(P<0.01)。見表1和圖5。

A,B:0 h； C,D:24 h;A,C:Control group; B,D:Exo group.

2.5 2組HeLa細胞中Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達水平與對照組比較，Exo組HeLa細胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達水平均明顯升高(P<0.01)。見表2和圖6。

表2 2組HeLa細胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達水平

Lane 1：Control group；Lane 2：Exo group.

3 討 論

外泌體是一種細胞外囊泡，直徑為50～140 nm，由細胞經過內吞、融合-外排等調控過程形成；外泌體通過攜帶蛋白質、核酸等生物活性小分子在細胞之間進行信號傳遞[5]。外泌體可從各種體液、細胞培養液上清中分離，其功能和組成由其細胞來源決定[6]。外泌體在惡性腫瘤微環境中含量非常豐富，在惡性腫瘤的侵襲和轉移中發揮重要作用[7]。如腫瘤來源的外泌體增強涎腺腺樣囊性癌細胞的侵襲和轉移[8]，M2巨噬細胞來源的外泌體促進結腸癌細胞遷移和侵襲[9]，食管癌細胞來源外泌

體促進食管癌細胞的遷移和侵襲能力[10]，胰腺癌外泌體促進腫瘤轉移[11]。本研究采用超速離心法成功分離得到宮頸癌HeLa細胞外泌體，并發現HeLa細胞來源外泌體可促進HeLa細胞本身侵襲和遷移能力，表明宮頸癌HeLa細胞外泌體在其自身侵襲和遷移過程中也發揮重要作用，但其作用機制尚不清楚。

為探討宮頸癌HeLa細胞外泌體在宮頸癌HeLa細胞侵襲和遷移中的作用機制，本文作者對HeLa細胞中Wnt/β-catenin信號通路及其下游基因進行研究，結果顯示：宮頸癌HeLa細胞來源外泌體可升高HeLa細胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達水平。Wnt/β-catenin信號通路在惡性腫瘤細胞的侵襲和遷移中發揮重要作用，宮頸癌的侵襲遷移與Wnt/β-catenin信號通路關系密切[11-12]。β-catenin在細胞中以游離型和結合型兩種形式存在，結合型β-catenin通過與上皮鈣黏蛋白結合調節惡性腫瘤細胞之間的黏附；游離型β-catenin通過Wnt信號通路作用于惡性腫瘤細胞核內的轉錄因子淋巴增強因子/T細胞因子(LEF/TCF)在惡性腫瘤的發生發展過程中發揮重要作用[13-14]。Wnt/β-catenin信號通路的激活機制比較復雜，在Wnt蛋白缺失的情況下，細胞中的β-catenin被磷酸化，磷酸化的β-catenin由蛋白酶降解，因此在細胞內保持比較低的水平；在Wnt蛋白存在的條件下，β-catenin磷酸化水平低，導致胞內β-catenin大量積累，隨后進入細胞核中，可在細胞核中與LEF/TCF形成復合物，調控相關基因表達，參與惡性腫瘤細胞的侵襲和遷移過程[15-16]。TCF家族為Wnt信號通路的分子開關，在惡性腫瘤的侵襲和轉移中發揮重要作用，尤其是TCF4與惡性腫瘤的發生發展有密切關聯[17-18]。在宮頸癌中Wnt/β-catenin信號通路激活，Wnt1和β-catenin蛋白表達水平升高，其下游的TCF4蛋白表達水平也升高。外泌體可通過Wnt/β-catenin信號通路發揮生物學作用，如脂肪來源間充質干細胞外泌體通過Wnt /β-catenin信號通路保護心肌免受缺血/再灌注損傷[19]；缺氧結直腸癌細胞來源外來體通過Wnt/β-catenin信號傳導促進血管生成[20]；骨髓間充質干細胞來源外泌體通過Wnt/β-catenin途徑促進胃癌進展[21]。本研究中宮頸癌HeLa細胞來源外泌體可升高HeLa細胞中Wnt1、β-catenin和TCF4蛋白表達水平，表明宮頸癌HeLa細胞來源外泌體可能通過促進Wnt/β-catenin 信號通路及其下游的TCF4基因抑制宮頸癌細胞的侵襲和遷移過程。

綜上所述，宮頸癌HeLa細胞來源的外泌體可促進宮頸癌細胞的侵襲和遷移能力，其機制可能與HeLa細胞來源外泌體可促進Wnt /β-catenin信號通路的激活及下游TCF4基因的表達有關。