miR-216a-5p和WASL在子宮內膜癌組織中的表達及其調控子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制

秦巧紅，張 楠，趙書君，李紅雨

(鄭州大學第三附屬醫院婦產科，河南 鄭州450052)

子宮內膜癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率居女性生殖系統腫瘤的第4位，并且有逐年上升的趨勢，且發病人群呈年輕化趨勢[1]。雖然通過早期的診斷和規范化治療，子宮內膜癌患者5年生存率逐年升高，但目前對子宮內膜癌發生發展的分子機制認識不足，晚期子宮內膜癌患者的治療效果仍不理想[2-3]。因此，研究子宮內膜癌的分子機制對于子宮內膜癌的早期診斷及治療均具有非常重要的意義。

微小RNA(microRNA，miRNA) 是一類長度為18～25 nt的高度保守的非編碼小RNA，可組裝成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，進而通過翻譯抑制或mRNA裂解作用于特定的基因靶點，在細胞分化、轉移、發育和凋亡中發揮重要作用[4-5]。miR-216家族是miRNA的一種，周胤健等[6]在研究子宮內膜癌miRNA表達譜時發現：miR-216b在子宮內膜癌中低表達，但miR-216a-5p在子宮內膜癌中的作用機制尚不清楚。濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征樣蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome like protein，WASL)屬于濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein，WASP)家族蛋白之一，參與調控肌動蛋白相關蛋白2/3(actin-related protein 2/3,ARP 2/3)相關通路[7-9]并參與多種癌癥的發生發展。

miR-216a-5p在不同癌癥中的作用與其靶基因有關，關于其在子宮內膜癌中的靶基因及其影響子宮內膜癌的機制還有待進一步研究。本研究探討miR-216a-5p與WASL是否存在靶向關系，并進一步分析miR-216a-5p靶向WASL對子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響，以期為子宮內膜癌的預防和治療提供新的靶點和方向。

1 材料與方法

1.1 細胞、組織標本和主要試劑子宮內膜癌HEC-1-B細胞購自中國科學院(上海)生物化學和細胞生物學研究所。組織標本為本院2017年8月—2018年5月手術切除的47例子宮內膜癌患者癌組織及癌旁組織，于-80 ℃條件下保存。本研究經本醫院醫學倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書。胎牛血清、胰蛋白酶和改良Eagle培養基購自美國Gibco公司，miR-216a-5p模擬物(miR-216a-5p)、miR-216a-5p 抑制物(anti-miR-216a-5p)、模擬物陰性對照(miR-con)、抑制物陰性對照(anti-miR-con)和小干擾RNA(siRNA)片段購自廣州銳博生物科技有限公司，pcDNA3.1載體和LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，psiCHECK2載體購自美國Promega公司，MTT試劑盒、DMSO、BCA試劑盒和PBS緩沖液購自美國Sigma公司，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京白奧萊博科技有限公司，TRIzol試劑、逆轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司，RIPA蛋白裂解液購自上海碧云天生物技術有限公司，抗體購自北京博奧森生物科技有限公司。Transwell小室(8.0 μm孔徑)和基質膠購于美國BD公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，多功能酶標儀購自德國BMG LabTech公司。

1.2 細胞培養和轉染子宮內膜癌HEC-1-B細胞采用含10%胎牛血清的改良Eagle培養基，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每2 d更換 1次培養基。選取處于對數生長期的細胞用0.25 %胰蛋白酶進行消化，然后接種于96孔板中，待細胞融合至70%～80%時，分為miR-216a-5p組、miR-con組、anti-miR-con組、anti-miR-216a-5p組、沉默對照(si-con)組、沉默WASL的siRNA(si-WASL)組和共轉染miR-216a-5p+pcDNA組及miR-216a-5p+pcDNA-WASL組，將上述各組不同轉染質粒與不完全培養基混合后，加入各組HEC-1-B細胞中，滴加至24孔板，37℃、5%CO2培養箱中培養48 h。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行轉染。

1.3 逆轉錄實時熒光定量PCR(Real-time RT-qPCR)法檢測組織和細胞中miR-216a-5p和WASL mRNA表達水平收集適量子宮內膜癌組織及癌旁組織和處于對數生長期的各組細胞，充分研磨后加入TRIzol裂解細胞，參照RNA抽提試劑盒說明書進行操作。檢測RNA純度和濃度合格后，使用逆轉錄試劑盒合成cDNA。擴增條件：94℃、 30 s， 64℃、30 s，72 ℃、40 s，共34個循環；72 ℃ 、8 min。以β-actin和U6為內參，采用2-△△Ct法計算miR-216a-5p和WASL mRNA表達水平。WASL引物：F 5′-TCCACACAACTCAGGTCCTC-3′，R 5′-GTGGTGTAGACTCTTGGCCA-3′； β-actin引物：F 5′-GGACCTGACTGACTACCTC-3′，R 5′-TACTCCTGCTTGCTGAT-3′； miR-216a-5p引物：F 5′-TGTCGCAAATCTCTGCAGG，R 5′-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA；U6引物：F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 靶基因預測和驗證通過生物信息學在線靶基因預測網站Target genes(http://www.Targetscan.org/)預測miR-216a-5p的靶基因，并確定其與靶基因的結合位點。

1.5 Western blotting法檢測組織和細胞中WASL蛋白表達水平收集適量子宮內膜癌組織及癌旁組織和處于對數生長期的各組細胞，加入RIPA裂解液裂解細胞后離心提取總蛋白，采用BCA試劑盒參照說明書對蛋白進行定量。蛋白樣品SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜上，封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗(辣根過氧化物酶標記)室溫孵育1 h，TBST洗膜后加入顯影混合液顯影。以β-actin為內參，應用凝膠成像系統分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值比值代表蛋白表達水平。

1.6 MTT法檢測細胞增殖活性收集適量培養24、48和72 h的各組細胞，分別加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后棄掉上清，加入150 μL DMSO振蕩反應10 min。采用酶標儀于490 nm波長下檢測細胞吸光度(A)值，以A值代表各組細胞增殖活性。

1.7 Transwell實驗檢測各組細胞中遷移和侵襲細胞數收集適量處于對數生長期的各組細胞，胰酶消化后重懸細胞，調整細胞濃度為1×105mL-1。取400 μL細胞懸液于Transwell小室的上室內，取600 μL培養基于下室內，37℃、5% CO2條件下培養過夜。取出小室，棄掉培養基，用棉簽小心地擦掉上室內的細胞后用PBS沖洗3次，加入4 %多聚甲醛固定30 min，0.1%結晶紫染色20 min，PBS沖洗3次。顯微鏡下隨機選取3個視野拍照，計算小室下表面附著的細胞數，即遷移細胞數。

取100 μL冰上融化的基質膠加入300 μL預冷的培養基，混合均勻，加入小室的上室內，使其均勻覆蓋，室溫干燥備用。調整細胞密度后參照上述細胞遷移實驗過程進行，顯微鏡下隨機選取3個視野拍照，計算小室下表面附著的細胞數，即侵襲細胞數。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗取適量對數生長期miR-Con和miR-216a-5p組細胞，psiCHECK2載體以螢火蟲熒光素酶活性為內參，野生型WASL基因表達載體psiCHECK2-WASL-3′UTR WT(WT-WASL)和突變型WASL基因表達載體psiCHECK2-WASL -3′UTR MUT (MUT-WASL)的表達為對照，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書進行操作，首先加入1×Passive Lysis Buffer置于4℃保持20 min后得到細胞裂解液，然后吸取40 μL細胞裂解液與20 μL螢火蟲熒光素酶緩沖液，混合均勻，檢測螢火蟲熒光酶熒光值；再加入20 μL 海腎熒光素酶緩沖液，混合均勻，檢測海腎熒光酶熒光值。

2 結 果

2.1 子宮內膜癌組織和癌旁組織中miR-216a-5p和WASL mRNA及蛋白表達水平Real-Time RT-qPCR檢測結果顯示：與癌旁組織比較，子宮內膜癌組織中miR-216a-5p表達水平明顯降低(P<0.05)，WASL mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)。Western blotting 法檢測結果顯示：與癌旁組織比較，子宮內膜癌組織中WASL蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖1和表1。子宮內膜癌組織中miR-216a-5p表達水平與WASL mRNA表達水平呈負相關關系(r=-0.317，P<0.01)。見圖2。

2.2 各組HEC-1-B細胞中WASL蛋白表達水平、細胞增殖活性、遷移細胞數和侵襲細胞數與miR-con組比較，miR-216a-5p組細胞中WASL蛋白表達水平、細胞增殖活性、遷移細胞數和侵襲細胞數均明顯降低(P<0.05)。與si-con組比較，si-WASL組細胞中WASL蛋白表達水平、細胞增殖活性、遷移細胞數和侵襲細胞數進一步降低(P<0.05)。見圖3和圖4(插頁十)及表2。

Lane 1：Adjacent tissue；Lane 2：Endometrial carcinoma tissue.

表1 子宮內膜癌組織和癌旁組織中miR-216a-5p和WASL mRNA及WASL蛋白表達水平

2.3 各組細胞雙熒光素酶報告基因檢測結果TargetScan數據庫預測結果顯示：WASL與miR-216a-5p之間存在結合位點(圖5)。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示：轉染野生型WASL基因表達載體WT-WASL后，與miR-con組比較，miR-216a-5p組WT-WASL載體的細胞熒光活性明顯降低(P<0.01)；而轉染突變型WASL基因表達載體MUT-WASL后，與miR-con組比較，miR-216a-5p組MUT-WASL載體的細胞熒光活性差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。Western blotting法檢測結果顯示：與miR-con組比較，miR-216a-5p組細胞中WASL蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)；與anti-miR-con組比較，anti-miR-216a-5p組細胞中WASL蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，表明miR-216a-5p可靶向調控WASL的表達。見圖6和表4。

圖2 子宮內膜癌組織中miR-216a-5p與WASL mRNA表達水平相關性分析

Lane 1: MiR-con group; Lane 2: MiR-216a-5p group; Lane 3: Si-con group; Lane 4: Si-WASL group.

表2 各組細胞中WASL蛋白表達水平、細胞增殖活性、遷移細胞數和侵襲細胞數

圖5 miR-216a-5p與WASL互補的核苷酸序列信息

表3 各組細胞雙熒光素酶報告實驗檢測結果

2.4 共轉染組細胞中WASL蛋白表達水平、細胞增殖活性、遷移細胞數和侵襲細胞數與miR-216a-5p + pcDNA組比較，miR-216a-5p + pcDNA-WASL組細胞中WASL蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，細胞增殖活性、遷移細胞數和侵襲細胞數明顯增加(P<0.05或P<0.01)，表明過表達WASL可逆轉miR-216a-5p對子宮內膜癌HEC-1-B細胞增殖活性、遷移和侵襲能力的抑制作用。見圖7和圖8(插頁十)及表5。

Lane 1：MiR-con group;Lane 2：MiR-216a-5p group; Lane 3：Anti-miR-con group; Lane 4：Anti-miR-216a-5p group.

表4 雙熒光素酶報告基因實驗檢測各組細胞中WASL蛋白表達水平

Lane 1:MiR-216a-5p + pcDNA group;Lane 2:MiR-216a-5p + pcDNA-WASL group.

表5 共轉染組細胞中WASL蛋白表達水平、細胞增殖活性、遷移細胞數和侵襲細胞數

3 討 論

子宮內膜癌是威脅女性生命健康的惡性腫瘤之一，采用傳統的手術聯合放療和化療治療效果不明顯且對人體傷害較大，新型靶向治療的出現可以在殺死腫瘤細胞的同時減少對正常細胞的損傷，是目前子宮內膜癌防治的研究方向和熱點[10]。miRNA表達異常參與多種癌癥的進展，影響腫瘤細胞的增殖、分化、轉移、侵襲和凋亡[11]。邵煥軍等[12]研究顯示：膀胱癌組織中miR-216a-5p表達降低，上調miR-216a-5p表達可抑制膀胱癌細胞的增殖并誘導細胞凋亡；ZHANG等[13]研究顯示：乳腺癌患者癌組織中miR-216a-5p低表達，通過靶向p21蛋白激活激酶2(p21 protein activated kinase 2，PAK2)調控乳腺癌細胞增殖和轉移。在宮頸癌細胞中miR-216a-5p也呈低表達[14]，但miR-216a-5p在子宮內膜癌中的作用尚未見報道。本研究結果顯示：與癌旁組織比較，miR-216a-5p在子宮內膜癌組織中低表達，WASL mRNA高表達，兩者呈負相關關系，表明子宮內膜癌發展過程中miR-216a-5p與WASL mRNA異常表達有關；過表達miR-216a-5p可抑制子宮內膜癌細胞的增殖和細胞遷移侵襲。miR-216a-5p在不同腫瘤中的作用及靶基因不同。本研究中靶基因預測結果顯示：miR-216a-5p與WASL之間存在靶向結合位點，進一步將野生型和突變型WASL表達載體與miR-con、miR-216a-5p共轉染后檢測熒光素酶活性，結果證明WASL是miR-216a-5p的靶基因。

WASL蛋白是調節ARP2/3的信號分子，其介導從細胞表面受體到肌動蛋白細胞骨架的信號，進而通過激活ARP2/3復合物加速肌動蛋白的聚合[15-16]。已有研究[17]表明：癌細胞的細胞膜受體數量、癌細胞形狀及癌大小與癌細胞的侵襲能力有關。MORRIS等[18]和WANG等[19]發現：WASL蛋白在結直腸癌肝轉移和食管鱗癌組織中均有表達。YANG等[20]研究發現:WASL蛋白在肝癌中廣泛存在; PENG等[21]也發現:在葡萄膜黑素瘤組織中WASL高表達，抑制其表達可抑制癌細胞的增殖。本研究結果顯示：沉默WASL后子宮內膜癌細胞的增殖活性、遷移細胞數和侵襲細胞數均明顯降低，說明WASL與子宮內膜癌的發生有關；進一步將miR-216a-5p 和 pcDNA-WASL共轉染子宮內膜癌細胞，miR-216a-5p對子宮內膜癌細胞的抑制作用得到部分逆轉。

綜上所述，WASL是miR-216a-5p的靶基因，過表達miR-216a-5p可通過靶向負調控WASL的表達抑制子宮內膜癌細胞的增殖活性、遷移和侵襲能力，進而影響子宮內膜癌的進展。本研究結果為miR-216a-5p靶向防治子宮內膜癌提供了一個新的方向。