葛根素對去卵巢大鼠骨質疏松性骨折骨痂血管形成的影響

鮑根強 肖春來 張國輝 李華 趙曉亮 王泉

哈勵遜國際和平醫院手足外科，河北 衡水 053000

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨微結構退化，骨脆性增加為主的一種全身性系統性疾病，骨折風險增高，骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)是OP最嚴重的并發癥，嚴重威脅老年人群的健康和生活質量[1]。骨質量下降導致骨質疏松，使得骨折愈合的組織學基礎變差，骨折愈合延遲[2]。因此，OPF的防治和治療已成為醫學研究的重點之一。中草藥治療OP歷史悠久，具備療效顯著、價格低、不良反應少等優點，研究發現葛根素可用于臨床OP的預防和治療，可促進去卵巢大鼠骨折愈合[3]。本研究主要探討葛根素對OPF骨痂血管形成及骨折愈合的影響，為OPF治療提供臨床應用理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

60只SPF級健康雌性SD大鼠，3月齡，體重(320±30)g，訂購于北京中國醫學科學院實驗動物研究所(合格證號SCXK 京2017-002)。葛根素注射液(100 mg/支，陜西安康制藥廠，100 mg/支，批號：1610053)，柜式X線照片機購置于美國Hologic公司，ELISA檢測試劑盒訂購于武漢云克隆科技股份有限公司，兔抗鼠VEGF和BMP-2多克隆抗體均購于武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1實驗分組及藥物干預：60只SPF級健康SD大鼠，于華北理工大學醫學動物實驗中心SPF級屏障環境伺養；實驗隨機分為假手術組、去勢組、葛根素組，假手術組僅切除部分脂肪組織，去勢組、葛根素組均行雙側卵巢切除術。4周后確認骨質疏松造模成功后，各組均行左側股骨干閉合性骨折髓內固定術，于造模成功后第2天給予不同藥物干預，假手術組、去勢組：皮下注射0.9% Nacl 5 mL/kg，1次/d；葛根素組：皮下注射葛根素35 mg/kg，1次/d。連續用藥6周。各組大鼠分籠飼養。

1.2.2構建去卵巢大鼠骨質疏松骨折模型：參照羅靜華等[4]構建去卵巢大鼠骨質疏松性骨折模型的建立與內固定方法，術后常規青霉素80萬U肌肉注射，預防感染。造模成功后于術后第2 天給予各組不同藥物干預。

1.2.3組織標本處理：攝片后急性大失血法處死大鼠，左心室采血3～5 mL，離心，收取血清1～2 mL，-20 ℃保存備用。剝離取出右股骨骨痂組織，10%甲醛固定24 h，10%硝酸脫鈣6周，制作組織切片，室溫保存備用。

1.2.4放射性(X線)檢查：術后6周進行X線攝片，觀察各組大鼠骨折端骨痂生長和骨折線模糊情況。每組選取20只大鼠，放射學評估采用Warden等[5]的X線評分系統進行評估，依據骨折斷端表現行骨折愈合評分，評分標準：沒有愈合：1分；骨痂形成不明顯：2分；骨折部分愈合：3分；骨折線逐漸消失，骨痂逐漸吸收消失：4分；完全愈合：5分。

1.2.5ELISA法檢測血清濃度：采用ELISA試劑盒檢測血清BMP-2和VEGF濃度，參照試劑盒說明書步驟進行操作，以450 nm波長測量各組的吸光度值(OD值)。

1.2.6HE染色：參照HE染色法實驗步驟進行操作[6]，光鏡下觀察染色并采集圖片。選取5個視野，計數新生毛細血管數，取其平均值。

1.2.7免疫組織化學染色法：參照免疫組織化學染色法步驟進行操作[7]。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行半定量分析，免疫組織化學染色結果采用免疫反應評分(IRS)進行測定。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 骨折愈合觀察及評分

假手術組骨折端骨折線幾乎模糊或消失，骨痂大量生長，體積較大，骨痂連接包饒骨折斷端周圍及骨皮質，連接緊密，并開始重建塑形，斷端髓腔再通；去勢組骨斷端骨折線依然清晰可見，骨痂未見明顯生長，斷端骨痂未連接，骨折愈合欠佳；葛根素組骨折線部分模糊或消失，較多骨痂生長，骨折端有骨痂包繞連接，部分愈合。去勢組較假手術組骨折愈合評分顯著降低(P<0.05)，葛根素組較去勢組骨折愈合評分顯著降低(P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 X線觀察骨折愈合情況 A：假手術組；B：去勢組；C：葛根素組。Fig.1 X-ray observation of fracture healing. A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

表1 各組大鼠骨折愈合評分比較Table 1 Comparison of fracture healing scores among rats in each group

2.2 血清BMP-2和VEGF濃度

去勢組較假手術組血清BMP-2和VEGF濃度均顯著降低(P<0.05)，葛根素組較去勢組血清BMP-2和VEGF濃度均顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清BMP-2和VEGF濃度比較Table 2 Comparison of serum BMP-2 and VEGF concentrations among the groups

2.3 骨痂組織學觀察

假手術組骨痂組織可見大量骨小梁生長旺盛，排列致密有序，互相交錯網狀，大量成骨細胞及新生小血管等成熟骨組織；去勢組骨痂組織可見少量骨小梁，生長稀疏，排列紊亂，大量纖維軟骨細胞等纖維組織，成骨細胞及新生小血管少見；葛根素組骨痂組織可見較多骨小梁，骨小梁生長較旺盛，排列有序，可見較多成熟的骨細胞，新生小血管較多。去勢組血管數顯著低于假手術組(P<0.05)，葛根素組血管數顯著高于去勢組(P<0.05)。見圖2和表3。

圖2 觀察骨痂組織形態結構變化(×200) A：假手術組；B：去勢組；C：葛根素組。Fig.2 Observation of the morphological changes of the epiphysis (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

表3 各組大鼠骨痂組織血管計數比較Table 3 Comparison of blood vessel counts of osteophytes among each group

2.4 骨痂BMP-2和VECF表達

BMP-2定位于成骨細胞胞漿及骨小梁的邊緣，VEGF定位于成骨細胞胞質及少量成熟軟骨細胞，陽性反應呈棕黃色。去勢組較假手術組BMP-2和VEGF陽性表達均顯著降低(P<0.05)，葛根素組較去勢組BMP-2和VEGF陽性表達均顯著增高(P<0.05)。見圖3、圖4和表4。

圖3 觀察骨痂組織BMP-2表達(×200) A：假手術組；B：去勢組；C：葛根素組。Fig.3 Observation of the expression of BMP-2 in osteophyte (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

圖4 觀察骨痂組織VEGF表達(×200) A：假手術組；B：去勢組；C：葛根素組。Fig.4 Observation of the expressions of VEGF in osteophytes (×200). A: Sham operation group; B: Castration group; C: Puerarin group.

表4 各組大鼠骨痂組織BMP-2和VECF表達比較Table 4 Comparison of expressions of BMP-2 and VEGF in osteophytes among rats in each group

3 討論

OP是中老年人的常見病、多發病，嚴重危害老年人的健康[8]。OPF作為OP最嚴重的并發癥，因其治療較正常骨折困難，且易于發生二次骨折，是臨床骨科的一大難題[9]。隨著我國人口的老齡化的加劇，OP和OPF的發病率逐漸上升，給家庭和社會帶來了沉重負擔。

婦女絕經后體內雌激素水平下降是引起絕經后骨質疏松癥的主要原因，雌激素代替療法(ERT)可預防治療OP[10]。雌激素可促進骨小梁生成和加速骨折的愈合，但是長期應用雌激素卻能帶來很多不良反應(如子宮內膜癌、血栓栓塞性疾病)[11]。葛根素是一種異黃酮衍生物，屬于植物雌激素，其結構類似雌二醇，具有某些雌激素樣作用，目前已經被廣泛應用于治療心腦血管疾病等[12]。葛根素通過與雌激素受體(ER)結合能增強成骨細胞的增殖與分化，促進成骨細胞的礦化功能，增加骨密度和骨強度，具有抗骨吸收、促進骨形成[13-15]。同時有研究表明也葛根素可以調節去卵巢大鼠OPF骨代謝，促進骨形成，加快骨折愈合[16]。

血管生成在骨發育、骨折愈合中起著重要作用。血管生成能提供骨愈合所需要的營養及各種成骨細胞成分，新生血管系統在骨發育、重塑、骨折修復和穩態中起著至關重要的作用，血管內皮細胞生長因子(VEGF)目前作為最重要的促血管生長因子，能促進內皮細胞的增殖和血管生成[17]。VEGF在血管內皮細胞增殖、遷移、滲透等方面起著重要調節作用，其誘導血管生成可促進骨再生與修復[18]。骨形態發生蛋白(BMPs)是最強有力的骨誘導劑，BMP能誘導間充質細胞分化為成軟骨細胞和成骨細胞，促進新骨形成，其中尤以BMP-2作用最顯著，BMP-2通過一系列級聯反應激活其下游信號分子促進成骨細胞分化和誘導成骨的能力。

本研究表明去勢組較假手術組骨折愈合評分、血清BMP-2和VEGF濃度、骨痂BMP-2和VEGF表達、微血管數均顯著降低(P<0.05)，葛根素組較去勢組上述指標均顯著增高(P<0.05)。去勢組骨痂組織可見少量骨小梁，生長稀疏，排列紊亂，間隙增寬，大量纖維軟骨細胞等纖維組織，成骨細胞及新生小血管少見；葛根素組骨痂組織為大量成熟骨組織，骨小梁生長旺盛，互相交錯網狀，排列致密有序，較多成骨細胞，新生小血管較多。說明葛根素通過促進去卵巢大鼠OPF骨痂組織BMP-2和VEGF表達，促進骨痂血管形成，進而加快骨折愈合。周雪明等[19]研究發現葛根素能改善骨折后的骨和骨骼肌的血流量。田發明等[20]研究發現仙靈骨葆可促進去卵巢大鼠OPF血管形成，促進骨折早期愈合。

綜上所述，葛根素通過介導去卵巢大鼠OPF骨痂BMP-2和VEGF表達，促進骨痂血管形成，改善骨組織形態學，加快骨折愈合。當然本實驗研究僅是初步結果，但其具體作用機制目前尚未完全清楚，還有待于進一步研究。因此，探討中西結合防治OP是未來研究的重點，同時也為中草藥的應用開辟了新的途徑。