人參活性糖肽的熒光標記鑒定及其在小鼠主要臟器組織中的分布

房曉雪，徐 偉，周婷婷，唐 燕，王春馳，姜瑞芝，邱智東，羅浩銘

(1.長春中醫藥大學藥學院中藥藥劑實驗室，吉林 長春130117；2.長春中醫藥大學藥學院藥物化學與中藥化學教研室，吉林 長春130117；3.吉林省吉測檢測技術有限公司研發部，吉林 長春130117)

天然產物中糖復合物如糖蛋白、核酸和多糖類成分均具有多樣的生物活性，在生理病理過程如免疫識別、組織修復和細胞功能等方面均扮演重要角色[1-4]。人參為五加科多年生草本植物，具有補氣固脫、健脾補肺和開心益智等作用[5-7]。前期動物實驗[8-12]證實：人參活性糖肽(panax ginseng active glycopeptide, PGG)可改善老年癡呆模型小鼠的學習記憶功能，并具有鎮痛和鎮靜催眠的功效。研究[13-16]表明：PGG可明顯抑制β淀粉樣蛋白25-35(Aβ25-35)誘導的細胞凋亡活性，具有潛在的神經保護作用。本研究分析PGG在動物體內的分布，確定其是否以腦組織為靶點。由于此類化合物結構復雜且缺少發光基團，難以進行體內示蹤，阻礙了對PGG作用機制的進一步研究。目前，常采用酶、金屬離子、同位素和熒光素等物質對糖復合物進行標記，以便對其組織內分布及代謝過程進行監測[17-19]。異硫氰酸熒光素(fluoresceine isothiocyanate，FITC)是一種在細胞生物學、免疫學和藥物研究領域應用較為廣泛的熒光素衍生物，其主要與被標記物中的伯胺基團反應形成硫脲鍵，從而實現熒光標記，因此常被用來標記蛋白質、抗體和核酸分子等[20-22]。PGG結構中除肽鏈N端的伯胺之外，帶有伯胺基團的賴氨酸質量分數為2.15%(與總蛋白比較)，為進行FITC標記提供了理論可能。此外，PGG較大的相對分子質量和極性限制了其通過血腦屏障(blood brain barrier, BBB)進入中樞神經系統(center nervous system, CNS)發揮藥效的能力。在PAN等[23]證明促腎上腺皮質激素(adrenocorticotropic hormone，ACTH)等肽類物質可完整穿越BBB之前，學術界普遍認為肽類等大分子難以穿越BBB。隨著研究技術的不斷深入，越來越多的大分子，如神經營養因子3(neurotrophin-3，NT-3)、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經營養因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、IgG、白蛋白和P-糖蛋白等已被證明可透過BBB到達CNS發揮藥效作用[24-25]，因此PGG具有通過BBB的潛力。目前關于PGG在小鼠不同組織中的分布情況及其靶向趨勢的研究較少。本研究利用FITC對PGG進行標記，并利用熒光分光光度法測定小鼠體內藥物的組織分布和靶向效率，探討PGG通過BBB到達CNS發揮藥效的依據，以期為今后研究人參糖肽類成分通過BBB的轉運機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器

昆明種小鼠78只，雄性，體質量(20±2)g，由吉林大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(遼)2015-0001。PGG由本課題組自制[5-12]。FITC(山東西亞化學股份有限公司)，苯酚、碳酸鈉和硫酸(北京化工廠)。透析袋(上海源葉公司)，MS105DU型電子分析天平(吉林省計量科學研究院)，UV-5100型紫外可見分光光度計、IRAffinity-1S型傅里葉紅外光譜儀和F-2700型熒光分光光度計(日本島津公司)，WH-2型渦旋混勻器(上海滬西分析儀器廠有限公司)，78-1型磁力加熱攪拌器(金壇市江南儀器廠)，R-201型旋轉蒸發儀(上海申須生物科技有限公司)，H/T16MM型臺氏高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)。

1.2 PGG的標記和純化

稱取200 mg PGG，溶于10 mL蒸餾水中，采用0.5 mol·L-1碳酸鈉調節pH值至8.5，加入25 mg FITC室溫下避光反應過夜，將反應物用0.1 kD的透析袋透析24 h。透析內液上Sephadex G-75柱純化，蒸餾水洗脫，流速1 mL·min-1，每管 5 mL，共80管，分別于波長280 nm處檢測肽類吸光度(A)值，苯酚-硫酸法反應后于波長490 nm處檢測糖類A值，以A值為縱坐標，管數為橫坐標，繪制折線圖。根據洗脫圖形，收集相應洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到PGG-FITC，避光保存。

1.3 紫外光譜掃描

分別稱取PGG、PGG-FITC、FITC 1.5 mg，加入PBS緩沖液，配制成質量濃度為1.5 mg·L-1的溶液，在波長200～800 nm內進行紫外光譜掃描。

1.4 紅外光譜掃描

分別稱取PGG 1.085 mg、PGG-FITC 1.1 mg、FITC 0.015 mg和干燥的溴化鉀450 mg(按照PGG的熒光取代度為1.435%計算)，在瑪瑙研缽中研磨、混勻，取適量的混合品放入壓片模具中，在約12 MPa的壓力下2 min后，樣品被壓成半透明的薄片。將上述樣品置于紅外光譜儀中，在波數4 000～400 cm-1內進行紅外光譜測定(掃描樣品前需先壓1個溴化鉀空白片扣除水和CO2的干擾)。

1.5 熒光取代度測定[26]

精密移取質量濃度為0.122 0 mg·L-1的FITC溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL，分別加入7支錫箔紙包裹的刻度試管中，再加入PBS緩沖液定容至10 mL。以PBS緩沖液為空白對照，依次測定各管的熒光強度。以 FITC 的質量濃度為橫坐標(X)、熒光強度為縱坐標(Y)，繪制標準曲線，并計算回歸方程。將PGG-FITC樣品配制成質量濃度為1.020 1和2.550 3 mg·L-1的PBS緩沖液，測定其熒光強度，代入回歸方程，計算PGG-FITC的熒光取代度。

1.6 方法學驗證(以心臟組織中PGG-FITC的定量分析方法為例)

1.6.1 對照品溶液的配制 精密稱取FITC樣品6.01 mg，加入PBS緩沖液，配制成2.404 mg·L-1的對照品溶液。

1.6.2 標準曲線的繪制 精密移取空白組小鼠心臟勻漿液200 μL，分別加入“1.6.1”中對照品溶液0、1、5、20、60、80和100 μL，再加入PBS緩沖液2.5 mL，以0 μL為空白對照，測定熒光強度。分別以勻漿液中FITC質量濃度為橫坐標(X)、熒光強度為縱坐標(Y)繪制標準曲線，并計算回歸方程。

1.6.3 精密度實驗 精密移取空白組小鼠心臟勻漿液200 μL，再精密移取“1.6.1”中對照品溶液，配制成低、中和高質量濃度(0.000 89、 0.052 17和0.126 32 mg·L-1)FITC溶液。1 d內連續測定6次熒光強度，計算精密度和相對標準方差(relative standard deviation, RSD)，RSD值越小，準確度越高。

1.6.4 回收率實驗 取“1.6.3”中制備的低、中和高質量濃度FITC溶液，測定熒光強度，計算回收率和RSD值。

1.6.5 穩定性實驗 取“1.6.3”中制備的低、中和高質量濃度FITC溶液，-4 ℃放置24 h，分別于2、4、6、8、12和24 h測定熒光強度，綜合評價該方法穩定性。

1.7 PGG在小鼠不同組織中的分布

78只小鼠隨機分為13組，每組6只，其中6組小鼠按照355 mg·kg-1劑量尾靜脈注射PGG-FITC(PGG-FITC組)，6組小鼠按照5.09 mg·kg-1劑量尾靜脈注射FITC(FITC組)，1組小鼠尾靜脈注射PBS緩沖液作為空白對照組。給藥后分別于0.5、1.0、2.0、4.0、8.0和24.0 h頸椎脫臼處死小鼠并解剖，采集各組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、腸和胃組織。采用PBS緩沖液洗凈，濾紙吸干，精密稱質量，加入9倍體積PBS緩沖液，研磨，收集組織勻漿液，3 000 r·min-1離心15 min，取上清液200 μL，加入PBS緩沖液2.5 mL，混勻，采用熒光分光光度計在發射波長494 nm、激發波長515 nm 條件下測定熒光強度。 利用“1.6”中的回歸方程計算小鼠主要臟器組織中PGG-FITC和FITC水平。根據小鼠主要臟器組織中PGG-FITC和FITC水平繪制藥物濃度-時間曲線，采用梯形法計算藥時曲線下面積(AUC)值，并以AUC總和為參比，計算小鼠主要臟器組織中的靶向效率(Te)值，Te=AUC/∑AUC×100%。

1.8 統計學分析

2 結 果

2.1 PGG-FITC的純化和收率

為除去游離FITC，將反應產物通過24 h透析，透析內液經Sephadex G-75進一步純化，利用苯酚-硫酸法(490 nm)和紫外測定法(280 nm)分別間管檢測A值，以管數為橫坐標(X)、A值為縱坐標(Y)繪制折線圖，多糖和蛋白洗脫峰重合，按照洗脫圖收集30～60管洗脫液，濃縮，凍干，得到PGG-FITC 60 mg，收率為27%。見圖1。

圖1 Sephadex G-75洗脫曲線圖

2.2 紫外光譜分析

PGG在200～800 nm區間無明顯吸收峰，FITC在280 和490 nm處有明顯吸收峰，PGG-FITC在280和490 nm處有吸收峰出現，說明實現了FITC對PGG的熒光標記。見圖2(插頁一)。

2.3 紅外光譜分析

PGG在3 600、2 900和1 600 cm-1附近出現明顯糖類物質專屬吸收峰，FITC在2 050、1 541、1 508、1 454、1 117和849 cm-1處出現明顯專屬吸收峰。 PGG-FITC在1 600～1 400 cm-1區間的吸收峰明顯增強，1 117和849 cm-1處出現明顯特征峰，進一步驗證了FITC對PGG的熒光標記。見圖3(插頁一)。

2.4 熒光取代度

以FITC作為標準品，相關性分析結果顯示：FITC質量濃度與熒光強度存在相關性(P<0.05)，其標準曲線回歸方程為：Y=22 460X+29.479 (r=0.999 7)，線性范圍2.44×10-3～1.71×10-2mg·L-1，檢測質量濃度為1.020 1和2.550 3 mg·L-1PGG-FITC溶液的熒光強度分別為329.6和922.9，計算PGG-FITC的熒光取代度為1.435%。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性關系 以FITC作為對照品，相關性分析結果顯示:FITC質量濃度與熒光強度存在相關性(P<0.05)，分別以組織勻漿液中FITC的質量濃度為橫坐標(X)、測定的熒光強度為縱坐標(Y)繪制標準曲線，線性回歸方程和相關系數(r)結果見表1，均滿足生物樣品測定要求。

表1 FITC在小鼠主要臟器組織中的線性回歸方程

2.5.2 精密度 按“1.6.3”中的方法測定低、中和高質量濃度各樣品的熒光強度，精密度RSD值均小于8%，均滿足生物樣品測定要求。

2.5.3 回收率 按“1.6.4”中的方法測定低、中和高質量濃度各樣品的熒光強度，回收率為90.12%～110.89%，RSD值均小于11%，均滿足生物樣品測定要求。

2.5.4 穩定性 按“1.6.5”中的方法測定低、中、高質量濃度各樣品的熒光強度，其穩定性良好，RSD值均小于10%，均滿足生物樣品測定要求。

2.6 FITC和PGG-FITC在小鼠主要臟器組織中的分布

FITC組小鼠主要臟器組織中藥物水平從高到低依次為肝、腦、胃、腎、腸、心、脾和肺組織，PGG-FITC組小鼠主要臟器組織中藥物水平從高到低依次為腦、心、肝、腎、脾、胃、肺和腸組織。與FITC組比較，PGG-FITC組小鼠主要臟器組織中藥物水平均明顯升高(P<0.01)，且腦組織中的藥物水平升高更為明顯。比較小鼠主要臟器組織中PGG-FITC和FITC的Te值，腦組織中PGG-FITC的Te值最高(53%)，說明PGG具有腦靶向趨勢。見表2。

表2 FITC組和PGG-FITC組小鼠主要臟器組織中藥物的AUC及Te

3 討 論

本研究通過PGG與FITC發生親核反應生成PGG-FITC，利用紫外分光光度法和紅外分光光度法對標記產物進行結構分析。在紫外光譜圖中，PGG在200～800 nm區間無吸收峰，而標記后產物PGG-FITC在280 和490 nm處出現明顯吸收峰，且2個吸收峰與FITC吸收峰基本重合，說明實現了FITC對PGG的熒光標記。在紅外光譜圖中，PGG在3 600、2 900和1 600 cm-1附近出現糖類物質吸收峰，表明PGG為糖類化合物。FITC在特征區的吸收峰以及歸屬：2 050 cm-1為S=C=N-吸收峰，1 541、1 508和1 454 cm-1為苯環中C=C骨架吸收峰，1 117 cm-1為C-O-C吸收峰，849 cm-1為苯環中C-H吸收峰；而標記后產物PGG-FITC的紅外光譜圖2 050 cm-1處未出現吸收峰，這是由于PGG中伯胺與FITC結構中S=C=N-基團反應生成-NH-(S=C)-NH-基團所引起，同時在1 600～1 400 cm-1區間及1 117和849 cm-1處吸收峰都明顯增強，這些特征峰均來自FITC結構中C=C、C-O-C和C-H基團，進一步證明實現了FITC對PGG的熒光標記。同時，紅外分光光度法檢測結果也說明反應產物通過透析、Sephadex G-75兩步純化可完全排除PGG-FITC中的游離FITC。以上2種鑒別方法均證明：PGG與FITC通過共價鍵相連，實現了FITC對PGG的熒光標記，其熒光取代度為1.435%。該方法操作簡單，價格低廉。此外本研究使用熒光分光光度法建立了小鼠不同組織中PGG-FITC和FITC的定量分析方法，經方法學驗證，該研究方法準確可靠。

近年來研究[27-28]顯示：不僅脂溶性較高、相對分子質量較小的藥物易透過BBB到達CNS發揮作用，相對分子質量較大的化合物也可以通過不同的轉移機制透過BBB發揮藥效，如多肽或蛋白等大分子物質可以通過吸附介導轉運、受體介導轉運或載體介導轉運等途徑實現跨BBB轉運，從而可以使大分子藥物透過BBB 到達CNS。隨著研究的不斷深入，越來越多的實驗數據證明：氫鍵鍵能對多肽或蛋白等大分子物質透過BBB也具有一定的影響，此外大分子藥物還可以通過胞吞、胞吐作用透過BBB 到達CNS發揮作用。本實驗通過小鼠尾靜脈分別注射PGG-FITC和FITC，采用熒光分光光度法測定小鼠不同組織中藥物水平，并計算藥時AUC和Te值，結果顯示：PGG具有明顯的腦靶向趨勢，說明腦組織對PGG有較強的攝取能力，證明PGG可以通過某些轉移機制透過BBB到達CNS發揮藥效。本研究結果可進一步證明本課題組前期藥效學實驗結果的正確性和可靠性，同時也為今后研究人參糖肽類成分通過BBB的轉運機制奠定了基礎。