人參皂苷Rg1聯合人參皂苷Rg3 對雄性生殖功能損傷模型小鼠生殖功能的改善作用

李 環， 曲振廷，錢鴻昊，徐 晗，曲 莉，張 晶，王洪艷，徐小磊

(1.北華大學醫學院環境衛生教研室，吉林 吉林 132001；2.吉林省吉林中西醫結合醫院兒科，吉林 吉林 132012)

男性不育為男科病中常見病和多發病。與十年前比較，男性精子質量和數量均有較大幅度下降，生育能力低下及不育的患者日益增多[1]。目前，西醫對不育癥治療的臨床效果并不理想，因此開發新的更安全和更有效的中藥制劑對臨床男性不育癥患者進行治療具有重要意義。

明朝醫藥學家李時珍認為“人參治男婦一切虛癥”。 服用人參粗提物后可以提高精子數量和精子活力，可以促進下丘腦-垂體-睪丸軸發揮作用[2-3]。人參皂苷 Rg1(ginsenoside Rg1)和人參皂苷 Rg3(ginsenoside Rg3)是人參中最具活性的成分，已有研究[4]表明：人參皂苷Rg1能明顯逆轉棉酚所致的精子數量降低，增強受損傷的精子活力，提高生精能力。但有關人參皂苷Rg1的生精作用機制目前國內外尚未見報道。人參皂苷Rg3能改善糖尿病大鼠抗鏈脲霉素的勃起功能障礙[5]，并能通過下調miR-26a保護小鼠睪丸間質細胞[6]。為了能取得較好的不育癥防治的效果,多藥聯用是現代臨床醫學的新手段。目前，人參皂苷Rg1聯合人參皂苷Rg3 對生殖功能損傷的改善作用及相關機制尚未見報道。

鄰苯二甲酸二丁酯(dinbutyl phthalate,DBP)是公認的環境污染物，文獻[7]報道及本課題組前期研究[8]表明：DBP具有明顯的生殖毒性，可引起睪丸質量減輕、生精小管萎縮和生精功能受損。因此，本研究采用 DBP 灌胃制備雄性生殖功能損傷小鼠模型[9]，同時給予人參皂苷 Rg1和人參皂苷 Rg3皮下注射，觀察小鼠精子質量、睪丸組織病理學、血清性激素水平及睪丸組織中縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)蛋白表達的變化，探討人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3 聯合應用對雄性生殖功能損傷小鼠生殖功能的改善作用及相關機制，為探索和開發天然、高效及安全的生精藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器清潔級C57BL/6雄性小鼠，6周齡，由吉林大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(吉)2010-0005。人參皂苷Rg1和Rg3(R)由吉林大學藥學院提供。DBP購自美國 Santa Cruz Biotechnology 公司，蘇木素和伊紅購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司，免疫熒光劑盒由武漢博士德生物公司提供，小鼠血清黃體生成素(luteinizing hormone，LH) 、卵泡刺激素 (follicle-stimulating hormone， FSH)和睪酮(testosterone，T)試劑盒由上海江來生物公司提供，Cx43兔多克隆抗體購于上海碧云天生物技術有限公司。WLJY-9000 彩色精子質量檢測系統購自北京偉力公司，DP20型正置熒光顯微鏡購于日本東京奧林巴斯公司。

1.2 實驗動物分組、造模和給藥采用 DBP 灌胃方法制作雄性生殖功能損傷小鼠模型[9]。本課題組前期實驗[8]結果顯示：400 mg·kg-1DBP灌胃給藥35 d可以成功制備雄性生殖功能損傷小鼠模型，故此方法用于本次模型制備。本研究選用28只清潔級6周齡C57BL/6雄性小鼠，適應環境 1 周后，按2×2 析因實驗設計并依據體質量隨機分為模型組(400 mg·kg-1DBP)、人參皂苷Rg1+DBP組(20 mg·kg-1人參皂苷 Rg1，400 mg·kg-1DBP)、人參皂苷Rg3+DBP組(20 mg·kg-1人參皂苷Rg3，400 mg·kg-1DBP)和聯合組(20 mg·kg-1人參皂苷Rg1，20 mg·kg-1人參皂苷Rg3，400 mg·kg-1DBP)，每組 7只。DBP溶于玉米油于每天上午8點灌胃給藥，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3溶于生理鹽水于每天下午2點皮下注射給藥，每天DBP灌胃給藥和 人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3皮下注射給藥各1次。小鼠飼養環境：溫度(22±2)℃，相對濕度(55±15)%，12 h/12 h明/暗交替；各組小鼠均自由進食和飲水，實驗期為35 d。實驗結束后，各組小鼠眼球取血，室溫靜置后， 2 500 r·min-1離心10 min，取血清，4℃冰箱保存樣品；脊髓脫臼處死，取睪丸稱質量并計算睪丸臟器系數，睪丸臟器系數= 睪丸質量(mg)/小鼠體質量(g)。

1.3 小鼠精子質量分析精子濾液制備：將雙側附睪放入平皿中，剪碎附睪組織，在預熱的生理鹽水中 37℃ 溫育1～2 min，制備精子混懸液，然后滴加到預溫的精子計數板上，應用WLJY-9000型精子質量檢測系統檢測各組小鼠的精子密度、精子活力和總畸形率。取4個視野，于2 min內完成檢測。

1.4 小鼠睪丸組織病理學檢查取小鼠一側睪丸(左)，4% 多聚甲醛固定，將固定好的睪丸組織常規脫水、浸蠟、包埋和切片處理，常規蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下拍照,觀察小鼠睪丸組織病理形態表現。

1.5 ELISA法檢測小鼠血清中性激素水平采用ELISA法測定各組小鼠血清中T、FSH和LH水平，所有的操作均按照試劑盒說明進行。

1.6 免疫熒光法檢測小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達水平將固定的睪丸組織病理切片經脫蠟至水、酶法修復抗原、血清封閉非特異性抗原(室溫孵育10 min)，滴加一抗(用5%BSA 配制，濃度為 1∶100)于濕盒內4℃孵育過夜。第2天取出濕盒后室溫復溫1 h，滴加生物素化二抗IgG(1∶100 稀釋)于濕盒內，37℃孵育30 min；滴加DyLight 488-SABC(1∶200 稀釋)，37℃避光孵育30 min。采用含有防熒光淬滅的甘油封片，1 h內完成采集圖像(熒光顯微鏡)，在每個切片中選取總面積，使用Image J軟件分析熒光強度，以平均熒光強度表示Cx43蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組小鼠睪丸臟器系數與模型組比較， 聯合組小鼠睪丸臟器系數明顯升高(t=1.34，P= 0.034)，人參皂苷Rg1+DBP組和人參皂苷Rg3+DBP組小鼠睪丸臟器系數差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠睪丸臟器系數

2.2 各組小鼠精子質量分析與模型組比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3組+DBP和聯合組小鼠精子密度和精子活力均明顯升高(P<0.01)，精子總畸形率差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組小鼠精子密度、精子活力和精子總畸形率

聯合作用的析因分析結果顯示：人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯合應用與小鼠精子活力存在交互作用 (F=6.704,P=0.016)。由圖 1可見： 2條量-效曲線隨劑量增加而遠離，提示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯合應用可使小鼠精子活力升高，具有協同作用。

2.3 各組小鼠睪丸組織病理形態表現小鼠睪丸組織經HE 染色后，光學顯微鏡400 倍下觀察生精上皮細胞層次、形態結構、脫落細胞和管腔受損程度。模型組小鼠睪丸組織生精上皮較薄，生精上皮細胞層次紊亂，甚至缺失，數量明顯減少，管腔中生精細胞嚴重脫落，而且管腔內精子數量稀少；與模型組比較， 人參皂苷Rg1+DBP組和人參皂苷Rg3+DBP組小鼠睪丸組織生精上皮變厚，生精上皮細胞排列較規則，數量有所增加，管腔中脫落細胞較少，支持細胞結構較完整，腔內精子數量增多；聯合組小鼠睪丸組織生精上皮較厚，生精上皮結構完整，各級生精細胞排列規則且數量較多，曲細精管之間排列緊密，腔內精子豐富，在生精小管之間均勻分布間質細胞。見圖2(插頁二)。

圖1 人參皂苷Rg1與人參皂苷Rg3聯合作用后小鼠精子活力分析

2.4 各組小鼠血清中性激素水平與模型組比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3組+DBP和聯合組小鼠血清中T和LH水平明顯升高(P<0.01)，FSH水平明顯降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組小鼠血清中性激素水平

聯合作用的析因分析結果顯示： 人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯合應用與小鼠血清中T水平存在明顯交互作用 (F=4.912,P=0.036) ，而與LH和FSH水平交互作用不明顯 (P>0.05)。由圖 3可見： 2條量-效曲線隨藥物劑量增加而遠離，提示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯合應用可使小鼠血清中T水平升高，具有協同作用。

2.5 各組小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達水平

與模型組(0.081 4±0.013 5)比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯合組小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達水平(0.108 6±0.006 9、0.122 9±0.025 0和0.187 1±0.025 6)均明顯升高(P<0.05)。見圖4(插頁二)。

圖3 人參皂苷Rg1與人參皂苷Rg3聯合作用后小鼠血清中T水平分析

聯合作用的析因分析結果顯示：2條量-效曲線隨藥物劑量增加而遠離(F=6.937,P= 0.018)，提示人參皂苷Rg1、人參皂苷Rg3聯合應用可增加小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達水平，具有協同作用。見圖5。

圖5 人參皂苷Rg1與人參皂苷Rg3聯合作用后小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達水平

3 討 論

全球男性不育發生率呈明顯上升趨勢，其中70%～90%是精子出現問題，表現為精子生成障礙、精子缺乏和精子活力不足。DBP作為一種重要工業原料，廣泛應用于各種生產和生活中，如增塑劑、橡膠、膠黏劑和香料等。人體通過空氣、水體和土壤等接觸DBP，從而干擾生殖系統內分泌激素水平，使血清T睪酮水平降低和 FSH 水平升高[10]，引發睪丸組織病理改變，表現為生精細胞脫落、生精小管損傷、生精細胞和支持細胞分離[11]。

在不育癥的治療中，現有的很多藥物都有明顯的不良反應，輔助生殖技術的使用也可能會增加嬰兒出生缺陷和兒童癌癥的風險。因此，尋求安全而有效的自然療法來提高生育能力成為大多數受不孕影響的人的主要選擇。被譽為“中草藥之王”的人參是治療不孕不育的常選藥物[12]。人參中的有效成份包括皂苷類、小分子肽、多肽和多糖等，其中人參皂苷是人參中最重要的有效成分。目前對人參皂苷的研究主要集中在其對中樞神經系統、心血管系統和血液系統等的保護作用及抗腫瘤的功效方面。近年來研究[4]顯示：人參皂苷能夠誘導生精、提高精子活力和數量及促進精子獲能。人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3在誘導生精、提高精子活力和數量的效果明顯，人參皂苷Rg3作為蛋白質能量合成促進因子，作用于細胞生殖周期的G2期。藥理學研究[13]證明：人參對生殖功能的2個主要方面，即性功能和生育能力都有較強影響。下丘腦-垂體-睪丸軸是調節睪丸功能的主要內分泌反饋系統。激素水平過高或過低都不利于精子的形成，如LH和FSH等能夠調節T的合成分泌，影響精子的質量。研究[14]表明：人參皂苷及人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1單體能刺激體外培養的垂體前葉細胞分泌FSH和LH。人參皂苷Rg1、人參皂苷Rh1和人參皂苷Ppt等對棉酚所致大鼠睪丸組織的結構損傷有一定的修復作用，使生精組織的形態和結構逐漸恢復，從而對生精障礙的治療起到一定作用[5]。人參皂苷還能通過抑制大鼠精子的凋亡來提高精子質量。

睪丸質量和臟器系數等指標可反映生殖器官的發育情況及損害情況。本研究結果顯示：人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3 聯合應用可使小鼠睪丸臟器系數明顯升高，單獨應用人參皂苷Rg1或人參皂苷Rg3睪丸臟器系數變化不明顯；精子質量分析，與模型組比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯合組小鼠精子密度、精子活力均升高，而各組小鼠精子總畸形率差異不明顯；人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3 聯合應用對于精子活力存在交互作用，提示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3 聯合使用對于改善小鼠精子質量具有協同作用；小鼠睪丸組織HE染色后觀察，模型組小鼠睪丸組織損傷嚴重，表現為生精上皮變薄且細胞層次紊亂，管腔中有生精細胞脫落，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯合組小鼠睪丸組織的損傷減輕，其中聯合組大鼠睪丸組織形態結構最好。本研究結果表明：人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3單獨和聯合應用均能抑制DBP所致的小鼠睪丸組織損傷，與文獻[15]報道一致。

DBP可通過破壞男性內分泌系統而間接損害睪丸，而DBP毒性作用的直接靶點可能是睪丸中的細胞[16-17]。本研究中血清性激素檢測結果顯示：與模型組比較，人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯合組小鼠血清T和LH水平均升高，FSH水平降低，聯合作用的析因分析結果顯示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3具有協同作用，提示人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯合應用可最大程度地減輕DBP誘導的小鼠內分泌系統損傷，從而保護小鼠睪丸組織。

大量研究[18-19]表明：睪丸內支持細胞-支持細胞間連接或者支持細胞-生殖細胞間細胞連接是內分泌干擾物作用于生殖系統的靶點，其作用于支持細胞的緊密連接，破壞細胞骨架組件；作用于細胞錨定連接蛋白，使細胞內蛋白質分布異常。睪丸和雄性生殖道中，作為相鄰細胞間的重要的細胞連接-縫隙連接(gap junction,GJ)廣泛存在。GJ是一種膜通道結構，對睪丸發育以及對精子發生具有重要意義[20]。如果睪丸支持細胞和血液睪丸屏障(blood-testis barrier, BTB)的完整性破壞，就可以導致精子生成出現障礙。有研究[21-22]顯示：BTB 的細胞連續重塑和細胞連接動力必須通過GJ的緊密協調和調控，說明GJ在大鼠睪丸中維持BTB功能的重要性。在睪丸中構建GJ 細胞間縫隙通道[23]的十余種連接蛋白中， Cx43具有重要的生理功能，支持細胞特異性缺失Cx43會導致小鼠不育癥[16]。Cx43具有重要和獨特的生理功能，同時也可能是環境毒物誘導生殖功能障礙的良好靶標[24-25]。本課題組研究結果[26-27]也顯示：DBP誘導的支持細胞損傷與Cx43的下調有密切關聯，可擾亂肌動蛋白和波性蛋白等相關蛋白表達，破壞間質細胞GJ通透性屏障功能，進而影響生精功能。本研究結果顯示：人參皂苷Rg1+DBP組、人參皂苷Rg3+DBP組和聯合組小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達水平均高于模型組，聯合作用的析因分析結果表明人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯合應用可增加小鼠睪丸組織中Cx43蛋白表達，兩者具有協同作用。

綜上所述， 人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3可通過上調Cx43表達發揮生精保護作用，改善DBP所致的生殖功能損傷。人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3聯合應用可最大限度地減輕DBP所致的小鼠精子質量下降和小鼠睪丸組織損傷，通過調節生殖激素的水平來發揮保護生殖功能的作用，其機制可能與上調Cx43表達有關。本研究結果為人參皂苷的進一步開發和合理利用奠定了理論基礎，但人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg3生精作用的確切機制尚未明確，需從分子生物學水平繼續探討。