丹皮酚對心力衰竭大鼠心肌損傷的保護作用及其機制

高瑞敏，康玲玲，侯防震

(1.河北醫科大學附屬唐山工人醫院重癥醫學二科，河北 唐山 063000；2.河北醫科大學附屬唐山工人醫院心內四科，河北 唐山 063000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF) 是指由于心臟結構、心臟功能異常等導致心室充盈、射血能力受損引起的一種復雜的臨床癥狀群，是絕大多數心臟疾病患者發展的終末階段，病死率較高[1-2]。CHF多由心肌疾病、心肌梗死、血流動力學過度負荷和炎癥爆發等原因導致心肌損傷，誘發心肌結構以及功能變化，使得心室泵血或充盈功能低下[3]。CHF發生時，心肌細胞持續凋亡，而剩余的心肌細胞功能逐漸退化誘發心臟功能不斷惡化。因而心肌細胞的凋亡及心肌纖維化是心衰的主要病理基礎[4]。近年來，越來越多的研究[5-6]顯示：中藥及其提取物在保護心臟、防止心肌細胞凋亡及纖維化等方面具有獨特的作用。丹皮酚主要為中藥丹皮或徐長卿等的活性成分，具有抗炎鎮痛、神經保護、抑制脂質過氧化和抗過敏等作用，研究[7-8]顯示：丹皮酚對缺血再灌注大鼠心肌具有保護作用。有研究者將培養的高血壓病血瘀證患者的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)分別用不同濃度的丹皮酚含藥血清干預，證實丹皮酚能夠很好調節患者免疫功能,對高血壓病患者血管內皮細胞有很好的保護作用[9]。但丹皮酚對CHF患者的心肌保護作用及其藥理機制少見報道。本研究采用阿霉素尾靜脈注射建立CHF大鼠模型，觀察丹皮酚對CHF大鼠心功能的保護作用并探討其藥理學機制。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器SPF級Wistar大鼠60只，雄性，體質量180～220 g，購自河北省實驗動物生產有限公司,動物使用許可證號為SYXK(冀)2012-0002。實驗操作嚴格按照我國《實驗動物管理條例》進行，實驗動物均飼養于SPF級環境中，不限供應干凈水并按標準供應動物飼料，室內環境控制在日夜交替12 h/12 h，溫度控制在20℃～26℃，濕度控制在 50% ～60%范圍內。 大鼠腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素6 (interleukin-6，IL-6)ELISA試劑盒(美國Biolegend 有限公司)，鼠抗人Bax、B細胞淋巴瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cysteine aspartic acid protease-3, Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶8(Cysteine aspartic acid protease-8, Caspase-8)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Cysteine aspartic acid protease-9, Caspase-9)和細胞色素C (cytochrome C， Cyt-C)單克隆抗體和鼠抗人GADPH單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，阿霉素注射劑(山西普德藥業股份有限公司，批號151004) ，丹皮酚片劑(廣西億康藥業股份有限公司，國藥準字H45021119)。立式壓力蒸汽滅菌器、恒溫培養箱、電子天平、紫外可見分光光度計、光學顯微鏡和低溫高速離心機均由本院中心實驗室提供。

1.2 動物模型建立和分組給藥大鼠適應性飼養1周后，參照文獻[10]方法復制大鼠CHF模型。阿霉素總劑量15 mg·kg-1，每次2.5 mg·kg-1(10 mL·kg-1)，1周3次腹腔內注射，共進行2周。成模標準：首次阿霉素注射5周后行超聲心動圖檢查，大鼠心腔擴大且左室短軸縮短率 (left ventricular fractional shortening，LVFS)<30%。成模大鼠共43只，隨機分為4組：模型組(10只)、卡托普利組(11只)、低劑量丹皮酚組(11只)和高劑量丹皮酚組(11只)?？ㄍ衅绽M大鼠灌胃給予卡托普利25 mg·kg-1，低和高劑量丹皮酚組大鼠分別灌胃給予75和150 mg·kg-1丹皮酚[11]，每日1次，連續給藥5周。另隨機選取同批次正常大鼠10只作為對照組，對照組和模型組大鼠灌胃給予等量蒸餾水。每周記錄體質量1次。

1.3 各組大鼠心功能指標檢測各組大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉 (50 mg·kg-1)麻醉，仰位固定，頸部正中切口，鈍性分離右側頸總動脈，結扎遠心端，將充滿1%肝素的導管自右頸總動脈徐緩進入，另一端連接PowerLab生物信號采集與分析系統，密切觀察壓力曲線，待導管進入左心室，即示波顯示為左心室壓力曲線后，穩定5 min，記錄心功能指標。檢測指標包括平均動脈壓(mean arterial pressure, MAP)、心率(heart rate, HR)、左室舒張末壓(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左室收縮壓(1eft ventricular systolic pressure，LVSP)、左室內壓最大下降速率(1eft ventricular maximal rates of pressure fall，-dp/dtmax)和左室內壓最大上升速率(1eft ventricular maximal rates of pressure rise，+dp/dtmax)。連續測量5次，每次間隔3 min，以平均值作為結果。

1.4 ELISA法檢測大鼠血清中TNF-α和IL-6水平末次給藥后，麻醉大鼠，取眼眶外周血分離血清，采用 ELISA 試劑盒檢測大鼠血清中血清中 TNF-α和IL-6水平，單位為ng·L-1。

1.5 Western blotting法檢測各組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白表達水平末次給藥后，隨機選取5只大鼠頸椎脫臼處死，在無菌操作下取出心臟組織于蛋白裂解緩沖液中勻漿, 按照參考文獻[12-13]的方法，分離提取各個大鼠心臟總蛋白，蛋白于SDS-PAGE 膠上進行電泳分離并轉膜，脫脂牛奶(5%)封閉， 于4 °C搖床中用稀釋1 000倍的一抗(Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Cyt-C和GADPH)孵育過夜，PBS洗膜3次，稀釋5 000倍的二抗孵育 1.5 h, PBS洗膜3次，ECL 化學發光試劑盒顯像。利用化學發光熒光成像儀的圖像分析功能對條帶灰度進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值代表目的蛋白表達水平。

1.6 HE染色觀察大鼠心肌組織病理形態表現末次給藥后，隨機選取5只大鼠麻醉后，在無菌操作下取出心臟，取一部分組織塊置于10%甲醛溶液中固定，進行常規石蠟切片，厚度為4 μm，HE染色，中性樹膠封片后于LEICA DMLB型光學顯微鏡下觀察大鼠心臟組織病理形態表現。

2 結 果

2.1 各組大鼠體質量造模前各組大鼠體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)；造模后，與對照組比較，模型組大鼠的體質量明顯降低(P<0.05)；給藥后，與模型組比較，卡托普利組和低、高劑量丹皮酚組大鼠體質量明顯增加(P<0.05)，其中以高劑量丹皮酚組大鼠體質量增加更明顯。見表1。

2.2 各組大鼠心功能指標與對照組比較，模型組大鼠HR降低(P<0.05)，MAP明顯升高(P<0.05); 與模型組比較，卡托普利組和高劑量丹皮酚組大鼠HR升高(P<0.05)，MAP明顯降低(P<0.05) ；與卡托普利組比較，低和高劑量丹皮酚組大鼠HR和MAP差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組比較，模型組大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低(P<0.05)，LVEDP明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組及低、高劑量丹皮酚組大鼠LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均不同程度升高(P<0.05)，LVEDP不同程度降低(P<0.05)，其中以高劑量丹皮酚組效果較好。見表2。

表1 各組大鼠體質量

表2 各組大鼠大鼠心功能指標

2.3 各組大鼠血清中 TNF-α和IL-6水平給藥5 d 后,與對照組比較，模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，卡托普利組和低、高劑量丹皮酚組大鼠血清中TNF-α和IL-6水平明顯降低 (P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清中TNF-α 和IL-6水平

2.4 各組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白表達水平與對照組比較，模型組大鼠心肌組織中Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Cyt-C蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，卡托普利及各劑量丹皮酚組大鼠心肌組織中Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Cyt-C蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。見圖1和表4。

2.5 各組大鼠心肌組織病理形態表現對左心室進行橫切，HE 染色后觀察：對照組大鼠心肌纖維排列整齊，未見破壞，細胞質豐富均勻，橫紋規律，細胞間隙正常；模型組大鼠心肌組織受損明顯，心肌細胞廣泛水腫，并且出現空泡變性，受損嚴重的心肌細胞可見小灶狀或片狀壞死，部分心肌纖維斷裂，肌原纖維溶解，心肌細胞間隙明顯增寬；卡托普利組和低、高劑量丹皮酚組大鼠心肌組織可見輕度心肌細胞肥大，心肌纖維排列和心肌間質水腫等現象明顯好轉。見圖2(插頁五)。

Lane 1: Control group; Lane 2:Model group; Lane 3: High dose of paeonol group; Lane 4: Low dose of paeonol group; Lane 5: Captopril group.

表4 各組大鼠心肌組織中凋亡相關蛋白表達水平

3 討 論

CHF發生發展的基本病理過程是心肌重構，其病理過程包括病理性心肌細胞肥大伴胚胎性基因再表達和心肌細胞凋亡與壞死、細胞外基質過度沉積和降解增加、心肌細胞分子結構的改變等[14]，其中心肌細胞凋亡及心肌纖維化是CHF的主要病理基礎。臨床治療中降低心肌細胞凋亡水平是CHF治療的有效策略[15]。因為在CHF發生發展過程中，心肌細胞的凋亡可由氧化應激、容量或壓力過度負荷及腎上腺素、血管緊張素Ⅱ和致炎細胞因子的過度釋放以及缺血、缺氧等誘導發生。心肌細胞凋亡導致心肌細胞大量丟失，而剩余的心肌細胞常發生功能下降，當心肌細胞數量降低到一定程度后，會使得CHF進行性惡化，形成一個惡性循環的病理過程[16]。

本研究通過阿霉素腹腔注射構建CHF大鼠模型，結果顯示：對照組大鼠外觀和行為均正常，造模大鼠阿霉素注射5周后超聲心動圖檢查顯示心腔擴大，LVFS<30%，且造模大鼠毛發改變、皮膚紫紺、四肢水腫、呼吸頻率加快和行動遲緩等均符合CHF的特征，證明成功建立CHF模型。 HR、MAP、LVEDP、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax是動物實驗評價心臟功能的關鍵指標[17-18]。本研究結果顯示：模型組大鼠MAP、LVEDP升高而HR、LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax明顯降低，表明大鼠心臟功能明顯下降，而經丹皮酚治療后, 模型大鼠心功能指標明顯改善，大鼠心肌組織中Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Cyt-C凋亡相關蛋白表達水平明顯降低，抗凋亡蛋白Bcl-2明顯升高。本研究中組織形態學觀察顯示：丹皮酚能明顯減輕CHF大鼠心肌損傷，改善心肌纖維斷裂、心肌細胞水腫和結構破壞等，且高劑量丹皮酚組效果更好。有研究[19-20]表明：丹皮酚可增強抗氧化防御系統，激活Bax、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9等抗細胞凋亡信號通路因子，從而起到保護心肌的作用。臨床研究[21-22]顯示：CHF患者血清中炎癥因子 IL-6和TNF-α水平隨著心功能的惡化而逐漸升高， IL-6和TNF-α 水平是CHF嚴重程度的重要預測指標，細胞因子系統的持續激活是導致心室重塑和心衰惡化的重要原因。本研究選用經典的血管緊張素轉換酶抑制劑卡托普利作為陽性對照藥，結果顯示：卡托普利對CHF大鼠體征及一般狀態的改善效果較高劑量丹皮酚組差，對血清IL-6和TNF-α的抑制作用較不同劑量丹皮酚組作用強，提示卡托普利在抗炎和抗細胞損傷方面比較有優勢，但是在心功能改善和抑制心肌纖維化方面，卡托普利與丹皮酚比較無明顯差異，且高劑量丹皮酚在大鼠心功能保護及抗心肌細胞凋亡方面效果更好。