鹽酸小檗堿對宮頸癌HeLa細胞外泌體的影響及其機制

王 景，葛 靜，王 旭，房桂英，代麗麗，劉 晶

(河北醫科大學第一醫院婦產科，河北 石家莊 050030)

宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，發病率僅次于乳腺癌，近年來宮頸癌的發病趨向于年輕化，嚴重影響女性健康。癌細胞轉移和侵襲容易引起機體多器官功能衰竭和血管破裂，發生失血性休克，死亡率極高。宮頸癌的發生發展過程復雜，涉及到體內多種物質和基因的參與，其中外泌體作為一種細胞外囊泡，是微環境中細胞間通訊的重要載體[1-2]。在腫瘤進展過程中，癌細胞通過外泌體與內皮細胞、間質細胞和免疫細胞相互作用，促進腫瘤發生發展[3]。小檗堿又名黃連素，從黃連和黃柏等中草藥中提取獲得，是一種常見的異喹啉類生物堿，具有抗病原微生物的功效。研究[4-7]顯示：鹽酸小檗堿可以通過促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞轉移以及增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性等方式，發揮其對肺癌、胃癌、鼻咽癌和肝癌等不同腫瘤細胞的預防及治療作用。目前，國內外尚未見鹽酸小檗堿在抑制宮頸癌細胞外泌體分泌方面的相關研究報道。本研究主要通過觀察鹽酸小檗堿對宮頸癌HeLa細胞釋放外泌體的干預作用及其對癌細胞增殖和轉移能力的影響，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器宮頸癌HeLa細胞株購自中國科學院細胞庫。鹽酸小檗堿片(規格0.1 g/片)，華中藥業股份有限公司生產，批準文號：國藥準字H42021425。蛋白質定量試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司，培養基購自海科倫公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自加拿大Stemcell公司，噻唑藍(MTT)細胞增殖和細胞毒性檢測試劑盒購自索德國萊寶公司，兔抗人CD63 單克隆抗體、兔抗人CD81單克隆抗體和兔抗人 β-actin單克隆抗體均購自英國Abcam公司，兔抗人磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase, Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。Transwell小室購自美國Millipore公司，TGL-16MS型高臺式速離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司)，光學顯微鏡(日本Nikon公司)，DYY-12型多功能電泳儀 (北京六一生物科技有限公司)。

1.2 細胞培養將FBS于4℃、100 000 g離心70 min，棄去沉淀，得到無外泌體的FBS。將宮頸癌HeLa細胞培養于含10% FBS的H-DMEM培養基，置于37℃、5% CO2培養箱孵育，待生長至80%融合度時進行傳代培養。

1.3 外泌體蛋白提取和定量取對數生長期HeLa細胞，采用含10% FBS的培養液調整細胞濃度至5×107mL-1，分為對照組和低、中、高劑量鹽酸小檗堿組，對照組加入完全培養液，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組分別采用含有10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的培養液培養24 h，800 r·min-1離心5 min，收集HeLa細胞，用胰酶消化，參照文獻[8]采用超速離心法提取外泌體，500 g離心10 min，取上清液，12 000 g離心20 min，經220 nm濾膜過濾，10 000 g超速離心90 min，去上清液，得到沉淀即為外泌體。加入裂解液裂解30 min后，4℃、12 000 g離心20 min，得到上清液為外泌體蛋白，按照Bio-Rad DC蛋白試劑盒說明書檢測外泌體蛋白濃度，經SDS-PAGE電泳2 h，轉印至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入兔抗人CD81抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人CD63抗體(1 ∶1 000稀釋)，PBS洗滌，加入二抗，孵育1 h，PBS洗滌，ECL法顯色，采用Quanitity One圖像分析軟件進行灰度分析，以β-actin作為內參，以目的蛋白條帶與內參條帶的比值作為目的蛋白表達水平。

1.4 MTT 法檢測細胞生長抑制率取對數生長期HeLa細胞，胰酶消化，用含有10% FBS的培養基配制成細胞密度為1×105mL-1的單細胞懸液，接種于96孔板中，37℃、5% CO2孵育過夜，貼壁后，棄去培養液，分為對照組和低、中、高劑量鹽酸小檗堿組，對照組加入完全培養液，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組分別加入含有10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的培養液，每個濃度設6復孔。于37℃、5% CO2培養箱中分別培養12、24和48 h后，棄去培養液，于各孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·L-1)培養4 h，棄去上清液，加入150 μL DMSO，置于搖床室溫避光振蕩10 min，采用酶標儀檢測各孔吸光度(A)值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率 =(對照組A值-鹽酸小檗堿組A值)/對照組A值 × 100%。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移率取對數生長期HeLa細胞，加入6孔板中，于37℃孵育過夜，用移液槍頭垂直劃痕。PBS沖洗，去除劃下的細胞，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組分別加入含10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的無血清培養基，對照組加入不含藥物的無血清培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養，于0和24 h時拍照，每孔設3個平行樣，計算細胞遷移率，以細胞遷移率代表細胞遷移能力。細胞遷移率 =24 h刮痕寬度/0 h刮痕寬度×100%。

1.6 Transwell小室實驗檢測穿膜細胞數取對數生長期HeLa細胞，以血清培養基洗滌，調整細胞密度至1×105mL-1，取細胞懸液200 μL加入Transwell上室，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組下室分別加入含有10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的FBS完全培養基，對照組加入不含藥物FBS完全培養基，每組3復孔。培養24 h，上室內腫瘤細胞向下室聚集。24 h后，取出培養板，用棉簽擦去上室內的細胞，下室細胞用甲醇固定，0.1%結晶紫染色，沖洗封片后，顯微鏡下隨機取5個視野對下室細胞進行計數，計為穿膜細胞數，以穿膜細胞數代表細胞侵襲能力。

1.7 Western blotting法檢測細胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平取對數生長期HeLa細胞，采用含10% FBS的培養液調整細胞濃度至5×107mL-1，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組分別用含有10、20和40 mg·L-1鹽酸小檗堿的培養液培養24 h，對照組加入不含藥物的培養液，800 r·min-1離心5 min，收集HeLa細胞，加入RIPA細胞裂解液裂解30 min，超聲破碎，12 000 r·min-1離心分離后取上清液，BCA法進行總蛋白質定量，上樣量為50 μg，120 V電泳分離蛋白，PVDF膜上轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗PI3K、Akt和p-Akt(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜，加入相應辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)37℃孵育2 h，ECL法顯色，用Quanitity One圖像分析軟件進行灰度值分析，以β-actin作為內參，以目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達水平。

2 結 果

2.1 各組HeLa細胞外泌體中外泌體標志物CD81和CD63蛋白表達水平不同劑量鹽酸小檗堿處理HeLa細胞24 h后，與對照組比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達水平明顯降低(P< 0.05)；與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組細胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達水平明顯降低(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達水平進一步降低(P< 0.05)。各組細胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達水平與鹽酸小檗堿呈明顯的劑量依賴性。見表1和圖1。

表1 各組HeLa細胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達水平

2.2 各組HeLa細胞生長抑制率處理24、48和72 h后，與對照組比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細胞生長抑制率均明顯升高(P< 0.05);與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組細胞生長抑制率均明顯升高(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細胞生長抑制率明顯升高(P< 0.05)。各組細胞生長抑制率呈明顯時間和劑量依賴性。見表2。

Lane 1: Control group; Lane 2-4: Low, medium, and high doses of berberine hydrochloride groups.

表2 作用24、48和72 h后各組細胞生長抑制率

2.3 各組HeLa細胞遷移率與對照組比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細胞遷移率均明顯降低(P< 0.05)；與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組細胞遷移率均明顯降低(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細胞遷移率明顯降低(P< 0.05)。各組細胞遷移率與鹽酸小檗堿呈劑量依賴性。見表3和圖2。

2.4 各組HeLa細胞的穿膜細胞數與對照組(224±19)比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組穿膜細胞數(157±13、134±12和109±8)均明顯降低(P< 0.05)；與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組穿膜細胞數均明顯降低(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細胞遷移率明顯降低(P< 0.05)。各組HeLa細胞中穿膜細胞數與鹽酸小檗堿呈劑量依賴性。見圖3(插頁六)。

2.5 各組HeLa細胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平不同劑量鹽酸小檗堿處理HeLa細胞24 h后，與對照組比較，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平明顯降低(P< 0.05)；與低劑量鹽酸小檗堿組比較，中和高劑量鹽酸小檗堿組細胞中PI3K及p-Akt蛋白表達水平明顯降低(P< 0.05)；與中劑量鹽酸小檗堿組比較，高劑量鹽酸小檗堿組細胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平明顯降低(P< 0.05)。各組細胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平與鹽酸小檗堿呈劑量依賴性。見表4和圖4。

3 討 論

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤，在中國具有高發病率和死亡率[9]。近年來研究[10-11]顯示：鹽酸小檗堿可抑制腫瘤細胞增殖，如乳腺細胞和宮頸癌細胞等。本研究結果表明：隨著鹽酸小檗堿劑量的增加，宮頸癌HeLa細胞的生長抑制率明顯升高，具有劑量依賴性，說明鹽酸小檗堿可明顯抑制宮頸癌細胞的增殖和生長，與有關研究[12-13]結果一致。腫瘤的轉移和浸潤涉及多因素、多步驟和多機制，是目前研究的重點。本研究結果顯示：不同劑量鹽酸小檗堿干預后，宮頸癌HeLa細胞的遷移、侵襲能力與對照組比較均明顯降低，且具有劑量依賴性，與李娜等[14]報道的鹽酸小檗堿具有抑制宮頸癌侵襲能力的結果一致。

表3 各組HeLa細胞遷移率

A: Control group; B-D: Low, medium, and high doses of berberine hydrochloride groups.

表4 各組HeLa細胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平

Lane 1: Control group; Lane 2-4: Low, medium, and high doses of berberine hydrochloride groups.

外泌體是近年來熱門生物學研究領域之一，其對腫瘤的遷移和侵襲有明顯影響[15-16]。研究[17]顯示：外泌體中上皮間質轉化相關蛋白能夠促進癌細胞的遷移能力。本研究采用超速離心法分離宮頸癌HeLa細胞外泌體，Western blotting法檢測結果顯示：不同劑量鹽酸小檗堿組癌細胞外泌體中CD81和CD63蛋白表達水平與對照組比較明顯降低，且具有劑量依賴性，說明鹽酸小檗堿能夠抑制宮頸癌細胞外泌體，從而降低細胞遷移和侵襲能力。

在癌癥發生發展過程中，PI3K/p-Akt信號通路被激活。PI3K是異源二聚體蛋白復合物，由PIK3CA基因編碼的催化亞基p110α亞單位和由PIK3R1基因編碼的調節性p85α亞單位構成[18]。在腫瘤發生時，PI3K介導的信號通路被異常激活，導致Akt依賴的信號傳導，導致腫瘤細胞增殖和遷移[19-20]。陳鳳霞[21]采用免疫組織法檢測患者宮頸癌組織和癌旁組織中PI3K和Akt表達水平，結果顯示：腫瘤組織中PI3K和Akt表達水平明顯高于癌旁組織。另有研究[22]表明：p-Akt在子宮內膜癌組織中表達率明顯升高，并與腫瘤的生長和轉移呈正相關關系。PI3K/Akt活性降低則可以降低癌細胞的遷移和侵襲能力。本研究結果表明：宮頸癌HeLa細胞中PI3K和Akt蛋白表達水平增加，說明PI3K和Akt是參與宮頸癌發生發展的信號物質，低、中和高劑量鹽酸小檗堿組細胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表達水平明顯降低，說明Akt磷酸化可作為PI3K活性指標，能夠反映PI3K信號通路的活性，鹽酸小檗堿能夠通過下調PI3K/Akt信號通路抑制宮頸癌細胞增殖。

綜上所述，鹽酸小檗堿能夠抑制宮頸癌細胞分泌外泌體，抑制癌細胞增殖，降低癌細胞的遷移和侵襲能力，其作用機制可能與下調PI3K/Akt信號通路有關，但關于PI3K/Akt信號通路下游調控外泌體分泌的分子機制有待進一步研究。