胡椒4-香豆酸：輔酶A連接酶Pn4CL基因的克隆及表達分析

范睿 胡麗松 伍寶朵 郝朝運

摘 ?要：根據(jù)胡椒4-香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase， 4CL）基因的部分序列設(shè)計引物，運用RACE方法獲得其家族成員的1個全長cDNA，命名為Pn4cl，長度2130 bp，開放閱讀框1638 bp，編碼545個氨基酸。預(yù)測Pn4CL分子量為59.57 kDa，理論等電點為5.70。該基因含有AMP-binding（AMP-binding enzyme）、CaiC[Acyl-CoA synthetase （AMP-forming） /AMP-acid ligaseⅡ]、PLN02246、AFD-class I等結(jié)合域，具有植物4CL所共有的保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化分析表明，Pn4CL與北細辛的同源性最高，同時與木蘭分支類植物的4CL聚類在一起，與菊分支的進化距離較近，與薔薇分支的進化距離較遠。亞細胞定位表明，該蛋白定位在細胞膜上。Real-time RT-PCR結(jié)果表明，該基因受外援激素SA和MeJA誘導表達，同時接種辣椒疫霉菌后，Pn4CL基因的表達量在抗/感2種胡椒中均出現(xiàn)先增加后減少的現(xiàn)象，并且在抗病種質(zhì)中表達量較高。研究結(jié)果為Pn4CL的功能研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：胡椒;4-香豆酸：輔酶A連接酶;克隆與表達

中圖分類號：S188 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： The full-length cDNA encoding 4-coumarate：coenzyme A ligase （4CL）， designated as Pn4CL， was isolated from black pepper using RACE. The sequence of Pn4CL was 2130 bp in length， containing a 1638 bp open reading frame， and encoding a polypeptide of 545 amino acids with a calculated molecular weight of 59.57 kDa and a PI of 5.70. The protein had four conserved domains of AMP-binding （AMP-binding enzyme）， CaiC （Acyl-CoA synthetase （AMP-forming）/AMP-acid ligase）， PLN02246， AFD-class I. Pn4CL had a closer relationship with Asarum heterotropoides and far from the evolution of Rosids by phylogenetic analysis. The subcellular localization indicated that the protein was on the cell membrane. The expression of Pn4CL could be regulated by exogenous MeJA and SA. When infected with Phytophthora capsici Leon， the expression of Pn4CL was significantly higher in the resistant germplasm than that in the susceptible germplasm by real-time RT-PCR.

Keywords： Piper nigrum; 4-coumarate：coenzyme A ligase （4CL）; cloning and expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.04.015

胡椒（Piper nigrum）有非常重要的藥用和工業(yè)價值[1-3]。我國胡椒的種植主要分布在海南、云南等省區(qū)，是世界第5大胡椒生產(chǎn)國，年產(chǎn)量可達4.12×104 t[4]。目前熱引1號（P. nigrum cv. Reyin-1）為我國胡椒主栽品種，推廣面積已經(jīng)占全國90%以上。但該品種對胡椒瘟病高感染，嚴重時直接導致減產(chǎn)甚至死亡。胡椒瘟病是一種氣候依賴型、傳染力很強的土傳性病害，主要由辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici Leon）引起的[5]。生產(chǎn)上仍采取預(yù)防為主、綜合防治為輔的措施，國際尚未選育出有效的抗病品種，主要用高毒化學殺菌劑，極易造成環(huán)境污染，且效果不佳[6]。胡椒主栽品種抗瘟病能力差，已成為影響包括我國在內(nèi)的世界胡椒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸問題。

在植物體中，木質(zhì)素可維持植株的機械組織（如纖維、厚壁組織）支撐力，而且可加強保護，增強植物體免受侵害[7-10]。4-香豆酸：輔酶 A 連接酶（4CL）是苯丙烷代謝途徑中木質(zhì)素途徑的重要合成酶，直接參與植物木質(zhì)素的生物合成。多種植物中廣泛存在4CL基因家族。目前，已經(jīng)在煙草、馬尾松、擬南芥、水稻等植物中進行4CL基因的克隆及表達分析[11-16]。同時4CL相關(guān)酶也被從大豆、玉米、火炬松、紫草和棉花中純化出來[17-18]。有研究表明，調(diào)控植株木質(zhì)素的含量或單體組成，可通過促進或者抑制4CL的表達來完成，從而積累或者脫除木質(zhì)素[5]。對胡椒的4CL基因的研究未見相關(guān)的報道。本研究采用RACE方法從根中克隆得到了1個4CL基因，同時對該基因的生物信息學進行了分析。根據(jù)該基因的結(jié)構(gòu)分析及表達模式研究可更加深入探討該基因在胡椒根部木質(zhì)素的合成作用機理及其對胡椒抗性的影響，借以深入揭示該基因在胡椒木質(zhì)素合成中的分子機理，為胡椒提高抗性提供一定的理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?植物材料及處理 ?材料主要為熱引1號胡椒和黃花胡椒（Piper flaviflorum），均采自萬寧胡椒種質(zhì)資源圃。胡椒扦插苗繁育及辣椒疫霉菌的針刺接種法參考范睿等[19]文獻。取樣后立即投入液氮，并迅速轉(zhuǎn)移至?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 ?試劑及核酸測序 ?SMARTer RACE cD?NA Amplification試劑盒購于Clontech，RNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒購自天根公司，大腸桿菌DH5菌株購自TaKaRa公司，SYBR Green qRT-PCR試劑盒購于伯樂有限公司，委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成核酸測序和引物合成工作。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總RNA提取及cDNA合成 ?總RNA及cDNA的合成均根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.2.2 ?胡椒4CL基因的克隆 ?對胡椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（SRR1583631）進行收索，根據(jù)PN8.22226（B498）序列設(shè)計5-RACE和3-RACE基因特異引物（表1），提取胡椒根部組織總RNA，按操作手冊進行RACE 擴增5-和3-端cDNA片段。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體同時轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆菌株送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 ?生物信息學分析 ?用BlastX對序列進行比對，進行蛋白理化性質(zhì)分析（http：//www.expasy.org /tools/protparam.html）、氨基酸序列的功能域（DNAMAN軟件）、預(yù)測蛋白是否存在信號肽和亞細胞定位（https：//www.predictprotein.org/）及構(gòu)建同源性和系統(tǒng)進化樹（DNAMAN軟件）等生物信息學分析。

1.2.4 ?亞細胞定位 ?設(shè)計亞細胞定位載體引物 PF074-F/R（表1），以含有目的基因的質(zhì)粒為模板擴增目的條帶，用In-fusion連接酶將PCR 純化產(chǎn)物連接入PCAMBIA1300-35S-GFP 載體。對生長1個月左右的擬南芥野生型葉片進行原生質(zhì)體制備，提取質(zhì)粒后經(jīng)PEG介導轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中，Nikon C2-ER熒光共聚焦顯微鏡觀察Pn4CL的亞細胞定位。

1.2.5 ?Pn4CL定量PCR分析 ?內(nèi)參及引物序列見表1。分別噴施1 mmol/L MeJA、5 mmol/L SA取材，取樣時間及材料處理、反應(yīng)條件均參考范睿等[19]文獻。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

基因的表達使用2CT方法進行定量，結(jié)果為平均值±SD。采用SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件進行，以P<0.05為差異顯著。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?Pn4CL基因RACE克隆

對基因cDNA 5端的擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物僅有1條特異性擴增條帶（圖1A）?；厥請D1A中箭頭所示的主條帶，克隆后經(jīng)測序和序列分析，確認為基因cDNA的5端序列。將第1輪PCR擴增產(chǎn)物稀釋50倍，然后第2輪PCR擴增用引物C358-2和UPM進行。電泳檢測擴增產(chǎn)物結(jié)果顯示，產(chǎn)物擴增僅有1條特異性擴增條帶（圖1B）。回收圖1B所示的主條帶，克隆后經(jīng)測序和序列分析，確認為cDNA的3端序列。測序結(jié)果表明，5-RACE產(chǎn)物和3-RACE產(chǎn)物大小分別為301和423 bp。將4CL序列進行拼接，獲得總長2130 bp的4CL全長cDNA序列，命名為Pn4CL。

2.2 ?Pn4CL基因的序列分析

該基因全長2130 bp，包含1個完整開放閱讀框，有1638 bp，5端非編碼區(qū)187 bp，3端非編碼區(qū)305 bp，一共編碼545個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，起始密碼子和終止密碼子分別為ATG和TGA，核酸序列與氨基酸對應(yīng)序列見圖2。

2.2 ?生物信息學分析

推測Pn4CL蛋白的分子式為C2660H4266N704 O789S26，編碼545個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為59.57 kDa，等電點為5.70，屬于穩(wěn)定蛋白。該蛋白中帶正電荷的殘基（Arg+Lys）為59，負電荷的殘基（Asp+Glu）為66，親水性平均數(shù)為0.628，預(yù)測為水不溶性蛋白。NCBI對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析表明，結(jié)果表明，4CL蛋白含有CaiC （Acyl-CoA synthetase）、AMP-binding、PLN02246、AFD-class I等結(jié)合域（圖3）。

將Pn4CL氨基酸序列與其他植物的4CL比較，其他作物的4CL氨基酸序列主要從NCBI網(wǎng)站上獲取，同源比對結(jié)果可以看出，胡椒和北細辛（Asarum heterotropoides）的同源性最高，無論是菊分支還是薔薇分支，其4CL酶的C端底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域序列都較保守（圖4）。構(gòu)建的進化樹表明，由結(jié)果可知，胡椒同樣和北細辛的同源性最高，木蘭分支類植物的4CL聚類在一起，與菊分支的進化距離較近，與薔薇分支的進化距離較遠（圖5）。

2.3 ?Pn4CL亞細胞定位

亞細胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，Pn4CL定位于細胞膜上。為了進一步研究Pn4CL的定位情況，以空載GFP為對照，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光蛋白分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)GFP的熒光信號分布于整個細胞中，而目標基因定位于細胞膜上（圖6）。

2.4 ?Pn4CL的表達模式分析

以PUB1為內(nèi)參，用real-time PCR方法分析Pn4CL表達模式。對胡椒的根、莖、葉、花和果等不同組織下進行表達模式分析，發(fā)現(xiàn)Pn4CL基因在不同組織中表達差異較大，在莖中的表達量最高，其次是根部，在葉、花和果中表達量均較低（圖7）。同時對不同激素處理后的熒光定量結(jié)果表明：Pn4CL表達受SA的誘導，處理24 h達到最高平，為初始水平的5.67倍（圖8）;Pn4CL表達受MeJA的誘導，處理24 h表達量最高，為第0 h的5.07倍（圖9）;在病原菌侵染后不同時間點進行根部cDNA取樣，并作為模板來研究Pn4CL基因的表達特征，結(jié)果表明：在接菌處理前，2種不同抗性胡椒的Pn4CL表達量均較低，而在收到辣椒疫霉菌誘導后，Pn4CL基因的表達量在黃花胡椒和熱引1號胡椒中都明顯增加，并且隨著處理時間的延長，該基因呈現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢;在處理后24 h達量達到最大，隨后開始下降。黃花胡椒與熱引1號比較發(fā)現(xiàn)，除了0和4 h，黃花胡椒的表達量均大于熱引1號胡椒（圖10），并且具有顯著差異。

3 ?討論

香豆酸：輔酶A連接酶（4-coumarate-COA?ligase， 4CL），可催化羥基肉桂酸酮形成肉桂酸輔酶A酯，是連接苯丙烷途徑中木質(zhì)素合成途徑的關(guān)鍵限速酶，同時也是形成G-型木質(zhì)素或S-型木質(zhì)素單化的重要酶。本研究通過RACE法得到胡椒Pn4CL，同時進行生物信息學分析。該基因編碼545個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)，為水不溶性蛋白，根據(jù)亞細胞定位發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細胞膜上，4CL是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，推測其蛋白在細胞膜上行使木質(zhì)素運輸?shù)裙δ堋CBI對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析結(jié)果表明，4CL蛋白含有AMP-bin?ding、CaiC、PLN02246、AFD-class I等結(jié)合域。該基因在被子植物、裸子植物和蘇類植物中被廣泛研究，如白毛楊、馬尾松、楊樹、落葉松、擬南芥[11-17]等。胡尚連等[12]克隆了慈竹4CL基因全序列，該序列CDS區(qū)全長為1674 bp，可編碼558個氨基酸，有2個4CL氨基酸保守域存在。

4CL主要參與木質(zhì)素和類黃酮合成，是植物苯丙烷代謝生物合成途經(jīng)的關(guān)鍵酶[18-19]。對楊樹4CL基因家族的研究發(fā)現(xiàn)[20]，只有同時具有LPY?SS-GTTGLPK保守結(jié)構(gòu)域和GEICIRG催化活化中，4CL基因能夠調(diào)控木質(zhì)素的合成。而同時都不具有這2種保守結(jié)構(gòu)域的家族基因則參與黃酮類物質(zhì)的合成[21]。目前已經(jīng)報道的參與木質(zhì)素合成的4CL蛋白序列中都同時含有這2個保守結(jié)構(gòu)域[22-23]。本研究中發(fā)現(xiàn)，這2個保守結(jié)構(gòu)域同時出現(xiàn)在胡椒4CL基因的蛋白序列中。推測Pn4CL基因主要參與胡椒木質(zhì)素合成。

由于SA、JA是植物抗病信號途徑中2種重要的植物激素，而木質(zhì)素是參與植物抗病響應(yīng)的重要物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)，SA和JA處理后均會誘導Pn4CL基因的表達。同時已有研究報道SA、JA處理煙草幼苗不僅可以提高幼苗抗病性，還能提高幼苗的過氧化物酶活性和木質(zhì)素的含量[24]。本研究還發(fā)現(xiàn)，胡椒Pn4CL基因在辣椒疫霉菌侵染下表達量出現(xiàn)了升高，在24 h達到最高值，其原因可能是病原菌的侵染調(diào)節(jié)了Pn4CL的轉(zhuǎn)錄，使Pn4CL蛋白維持在相應(yīng)的水平。其結(jié)果說明Pn4CL基因參與調(diào)控胡椒瘟病的抗性。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，胡椒不同抗性種質(zhì)受辣椒疫霉菌侵染后表達存在差異，接種后抗病種質(zhì)的表達量都略高于感病種質(zhì)。這說明Pn4CL基因的表達模式在不同抗性水平的胡椒種質(zhì)中也存在一定的差異。目前，對在植物中被病原體感染、輻射等外界刺激所激活而表達4CL基因的研究很多。經(jīng)過茉莉酸、傷害脅迫處理歐芹的成熟葉片，均瞬間高豐度增加4CL的mRNA[25]。Uhlmann等[26]用晚疫病菌（Phytophthora infestans）感染馬鈴薯葉片，4CL酶活性在接種12 h 后增加2倍。同時用致病寄生真菌（Peronos poraparasitica）的孢子感染擬南芥子葉[27]，發(fā)現(xiàn)該致病真菌強烈誘導At4CL1和At4CL2 mRNA的表達。上述研究結(jié)果表明，4CL基因都在病原菌侵染下均能提高表達來改變植物體內(nèi)木質(zhì)素的合成，是較為理想的目標基因。本研究中胡椒Pn4CL基因的克隆及表達為開展Pn4CL功能分析與胡椒抗病育種提供新思路。

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