體外敲降轉錄因子BCL11A對胚胎神經元特異性因子的影響

許 貞，李淑蓉，蘇炳銀△，解學敏△

1.成都醫學院 人體解剖與組織胚胎學教研室(成都 610500)；2.發育與再生四川省重點實驗室(成都 610500)；3.成都醫學院 病理與病理生理學教研室(成都 610500)

智力障礙(intellectual disability, ID)是一類具有廣泛遺傳異質性的神經系統疾病。在遺傳因素引起的智力障礙中，其中2號染色體p15至p16.1片段缺失型智力障礙是一類特異的ID亞型。BCL11A(B-Cell CLL/Lymphoma 11A，BCL11A/Ctip1)是具有鋅指結構的轉錄因子，其基因位于人類染色體2p16.1。在大腦皮層發育過程中，BCL11A對深層皮質中的投射神經元亞型形成發揮重要作用，與皮層發育的關鍵因子TBR1共定位在皮質層的第5層，抑制TBR1的表達可調節神經元發育過程中的重要基因網絡[1-2]。BCL11A在胚胎發育過程中對皮質神經元的調控作用鮮有研究。本研究旨在探討BCL11A對胚胎神經元特異轉錄因子的調控機制，為BCL11A缺失所致2p15-16.1缺失型智力障礙的發生機制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 細胞及胎鼠

293T細胞系(人腎上皮細胞系)來源于人胚腎細胞、SH-SY5Y細胞系(人神經母細胞瘤細胞系)來源于人神經母細胞。野生型C57/BL6小鼠購自成都達碩實驗動物公司。將野生型雄性及雌性成熟小鼠飼養于同一籠中進行配種，檢栓并計算孕齡，獲取胚胎11.5、13.5、15.5、18.5 d胎腦組織及出生后7 d小鼠大腦。

1.2 試劑及主要設備

免疫印跡技術(Western blot)全套試劑、RIPA、蛋白酶抑制劑(PMSF)購自上海碧云天公司，TRIZOL Reagent購自美國英杰生物有限公司，AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司，anti-Ctip1 antibody、anti-β-actin antibody購自上海艾博抗公司。二氧化碳細胞培養箱購自美國Thermo公司，電泳及凝膠成像系統、PCR儀及CFX96Tm Real-time system購自美國Bio-Rad公司，正置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司，冰凍切片機購自美國Thermo公司。

1.3 RT-qPCR 檢測目的基因表達

利用Trizol提取成年雄性小鼠心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨髓、大腦皮層，胚胎13.5、18.5 d胎腦組織及出生后7 d小鼠大腦，轉染siRNAs 48 h的293T細胞、SH-SY5Y細胞的總RNA。利用TransScript All-in-One First-Stand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒得到cDNA，參照試劑盒說明書步驟操作。以cDNA為模版應用實時熒光定量PCR檢測目的基因表達情況。設計相關引物序列見下表(表1)。

表1 相關的引物序列

1.4 Western blot檢測BCL11A蛋白表達

提取成年雄性小鼠心、肝、脾、肺、腎、肌肉、骨髓、大腦皮層及胚胎11.5、13.5、15.5、17.5 d胎腦組織蛋白，配置濃度10% SDS-PAGE分離膠、5%SDS-PAGE濃縮膠，電泳電壓60～120 V。轉膜結束后，將攜有蛋白的PVDF膜浸于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。1∶2 000(anti-Ctip1、anti-β-actin)稀釋一抗，4 ℃搖床孵育過夜。次日選取對應二抗進行室溫孵育； TBS-T將膜浸洗3次后加入顯色液，置于Bio-Rad成像系統進行拍攝，使用Image LabTM及Image J軟件進行分析。

1.5 免疫熒光檢測胚胎13.5 d BCL11A組織分布

PBS浸泡胚胎13.5 d小鼠大腦皮層冰凍切片(-20 ℃保存)至室溫。 4%PFA(多聚甲醛)室溫固定10 min。PBS漂洗3次后以Tritonx-100(0.5%)滴于組織區域，10～20 min后用PBS漂洗3次。進口胎牛血清滴加于組織區域，室溫封閉30 min。稀釋并滴加一抗(anti-Ctip1 antibody，1∶200稀釋)，4 ℃冰箱濕孵過夜。次日，PBS漂洗并孵育二抗：每組織區域滴加20 μL二抗(1∶400稀釋)，避光室溫孵育2 h后避光漂洗，滴加10 μL含DAPI的封片劑于組織區域，封片。利用正置熒光顯微鏡觀察，并使用激光共聚焦顯微鏡進行拍照。

1.6 細胞培養

將人神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y培養于含1%雙抗、10%FBS(胎牛血清)、DMEM/F12培養基中，置于37 ℃、5%CO2、95%濕度的恒溫培養箱中培養,待細胞融合度為80%～90%或2～3 d后傳代。細胞轉染操作前1 d，將SH-SY5Y細胞接種于24孔培養板中，接種密度以細胞密度達70%～80%為宜。

1.7 細胞轉染

按照TransIntroTMEL Transfection Reagent說明書操作。在24 孔板中培養SH-SY5Y細胞，使轉染時細胞融合度達70%；轉染前4 h更換無血清培養基。準備轉染復合體：用Opti-MEM稀釋siRNA干擾試劑，混勻；用Opti-MEM稀釋TransIntroTMEL Transfection Reagent，混勻；分別室溫放置5 min 后，混合步驟a和b兩個體系。輕輕混勻后室溫放置20 min。在24孔板中加入轉染復合體，輕輕混勻。 在37 ℃、5% CO2的培養箱中轉染4～6 h后可換含血清的培養基。繼續在上述培養箱中培養48 h后，收集細胞。

1.8 染色質免疫共沉淀分析神經元特異性因子的啟動子活性

在細胞懸浮培養基中，加入甲醛(終濃度1%)固定，加入甘氨酸終止反應，PBS清洗后，離心收集固定好的細胞，重懸細胞放冰上15 min，用PBS漂洗，用核制備緩沖液Ⅰ、Ⅱ重懸細胞，在冰上靜置10 min，中途渦旋震蕩兩次，離心后加入裂解液后劇烈渦旋，冰上靜置30 min。用超聲波破碎儀使染色質碎裂。加入超聲裂解液、RNase A，37 ℃恒溫箱靜置2 h，加入5 mol/L NaCl 4 μL、20 μg蛋白酶K。第2天用配好的有機溶液(酚/氯仿/異戊醇25∶24∶1)抽提DNA，取樣品進行電泳檢測。蛋白提取物中加Invitrogen?Protein A /Protein G Dynabeads，加入H3K4me3、H3K27me3抗體和BSA，再分別加入特異抗體和同種屬IgG，搖床上低溫過夜。在Protein A Dynabeads/Protein G Dynabeads中加入IP細胞裂解液和BSA,4 ℃冰箱孵育12 h。離心去掉上清。加入Protein A Dynabeads/Protein G Dynabeads, 低溫搖床處理2～3 h。低溫離心后棄上清，在沉淀中加入現配置的ChIP提取液，搖床上放置30 min，離心轉移到新的離心管。ChIP提取液和輸入樣品中，加入RNase A，37 ℃ 恒溫箱放置2 h。再加入NaCl與蛋白酶K混勻，65 ℃水浴裂解過夜。第2天抽提并純化DNA，再進行PCR反應，最后進行qPCR定量分析。空白對照組及實驗組分別進行3次獨立重復實驗，相關表達水平以2-ΔΔCT值計算。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 BCL11A在成年小鼠各器官組織及不同時期胎鼠大腦組織中的表達

結合課題組前期針對ENCODE來源基因芯片和GTEx數據進行了人源BCL11A表達譜分析，為進一步探索BCL11A在小鼠各器官組織中的表達情況，本實驗利用實時定量PCR檢測BCL11A在胚胎13.5 d胎鼠腦組織及成鼠各主要器官組織中的表達量。qPCR結果顯示BCL11A主要表達于胚胎13.5 d的胎鼠大腦、成年小鼠的骨髓、大腦皮層、脾臟、肺組織中，此結果與課題組前期所分析BCL11A在人類各器官組織表達譜相符(圖1)。

為探索BCL11A在小鼠胎腦發育過程中的動態表達變化，實驗選取胚胎13.5 d、胚胎18.5 d、出生7 d的小鼠大腦及成年小鼠大腦皮層進行定量分析，結果顯示小鼠胚胎發育關鍵時期胚胎13.5 d的胚腦中BCL11A表達量最高，胚胎18.5 d時表達相對下降，而出生后7 d和成年小鼠的大腦皮層，BCL11A表達量較胚胎發育時期明顯降低，提示BCL11A在胚胎皮質神經元發育的關鍵時期具有重要調控作用(圖2)。

2.2 Western blot檢測小鼠各器官組織及早期發育階段中BCL11A的表達

Western blot結果表明BCL11A在成年小鼠的大腦皮層、脾臟、肺中均有表達，且脾臟和大腦皮層的表達量較高，而在心臟、肝、腎臟、肌肉及骨髓中未表達，其蛋白水平與qPCR的結果相吻合。胚胎發育階段4個關鍵時間節點胚胎11.5、13.5、15.5、17.5 d中，BCL11A蛋白水平在胚胎13.5 d的胚腦達到最高，進一步提示在皮層神經元發育的關鍵時期胚胎13.5 d，BCL11A參與調控重要的神經元發育相關事件(圖3、4)。

2.3 在293T細胞中驗證siRNA的干擾效率

針對人源BCL11A的mRNA序列設計3組siRNA，并在人胚腎上皮293T細胞中分別轉染siRNA418、siRNA914、siRNA1132，收集細胞總RNA并反轉錄為cDNA，qPCR檢測BCL11A基因mRNA的表達變化。與對照組siGFP相比，轉入siRNA418、siRNA914及siRNA1132的細胞中BCL11A 的mRNA表達量明顯下降(P<0.001)，siRNA418中相對對照組，BCL11A表達量為(27.64±2.58)%，siRNA914中BCL11A基因RNA的表達量相對siGFP組為(49.32±4.12)%，siRNA1132中BCL11A基因RNA的表達量相對siGFP降至(21.28±1.23)%，3組siRNA均能有效降低目的細胞中BCL11A的mRNA水平(圖5)。

2.4 BCL11A在胚胎13.5 d胎鼠大腦皮層的表達

為進一步明確BCL11A在小鼠大腦的亞定位，選取其蛋白表達水平最高的時期，即胚胎13.5 d。取該時期小鼠胎腦進行BCL11A的免疫熒光實驗，并同時標記神經元特異性因子NeuN。免疫熒光染色檢測發現，BCL11A在小鼠胚胎神經元發育的關鍵時期胚胎13.5 d呈現陽性表達，并主要分布于該時期胚腦皮層區域，并與神經元特異性標志物NeuN具有相似表達與分布特性(圖6)。

2.5 siRNA干擾BCL11A的表達導致關鍵轉錄因子表達下降

將干擾效率最優的兩組siRNA(siRNA418和siRNA1132)分別轉染進293T細胞48 h后，檢測神經元特異轉錄因子的轉錄水平變化，發現BCL11A的表達降低致使皮質神經元發育關鍵基因Sox6、Tbr2、NeuroD2表達量明顯下降，提示BCL11A對于皮質神經元關鍵轉錄因子的表達具有正向調控作用(圖7)。

2.6 SH-SY5Y中BCL11A敲降后重要轉錄因子啟動子染色質活性改變

利用染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗初步考察BCL11A受干擾情況下，人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y中皮層發育關鍵基因的啟動子染色質活性變化。結果表明，在SH-SY5Y細胞中敲降BCL11A的表達，神經元前體細胞關鍵因子Sox6、Tbr2神經元關鍵因子NeuroD2的啟動子區域活性染色質修飾H3K4me3富集程度明顯降低。啟動子抑制性染色質修飾H3K27me3富集程度明顯增加。與此同時，膠質細胞與放射狀膠質細胞的關鍵基因GFAP、BLBP啟動子位點的染色質修飾無明顯變化(圖8～9)。

3 討論

BCL11A在大腦皮層投射神經元的發育過程中至關重要。BCL11A/Ctip1通過調節深層投射神經元亞型的特異性來精確控制新皮層的發育[3]。研究[4]證實了僅BCL11A基因的單倍體劑量不足就足以引起神經發育缺陷，BCL11A的突變會導致獨特的ID綜合征。目前已報道的2p15-16.1缺失型智力障礙的15個病例是由于其基因組2p15-16.1不同類型片段缺失而出現不同程度的智力發育延緩，畸形特征及微顱畸形特征[5-6]。深度解讀發育障礙研究計劃也揭示位于部分智力障礙患者中的 BCL11A 位點的錯意突變(MIM: 606557)與智力障礙的發生高度關聯[7-9]。

BCL11A作為核內轉錄因子，不僅在神經系統具有重要功能，在淋巴系統的發育、血液胎兒型珠蛋白正常表達亦具有重要的調控作用。BCL11A能夠在紅系祖細胞內募集重要的轉錄因子以調控下游紅系特異性轉錄因子的表達，在轉錄水平參與調控紅細胞的正常分化與形成[10]。

本課題通過qRT-PCR和Western blot方法發現并經免疫熒光證實BCL11A主要表達在小鼠胚胎13.5 d的胎鼠大腦皮層神經元。結合BCL11A在人類及小鼠的表達譜及胚胎發育關鍵時期胚胎13.5 d BCL11A的陽性表達，可以推論BCL11A在胚胎皮層發育時期發揮了重要作用。為初步探究其調控機制，課題組通過ChIP實驗發現在SH-SY5Y細胞中BCL11A表達降低的情況下，神經元前體細胞關鍵基因Sox6、Tbr2神經元關鍵基因NeuroD2的啟動子活性染色質修飾H3K4me3和抑制性染色質修飾H3K27me3富集程度出現了明顯改變。

既往研究[11]表明Sox6是非膽堿能皮層投射神經元的重要分類標記；Tbr2作為中間祖細胞標志物，可以增強小鼠皮質的神經發生，調節興奮性神經元的精細尺度空間和電路組織。NeuroD2有助于皮質細胞遷移的最終定位；結合ChIP實驗結果在BCL11A敲降的情況下，這3種大腦皮質形成的關鍵基因表達均明顯下降，這表明在皮質形成的過程中BCL11A可能對這3種基因起到了正向調節作用，結合BCL11A在皮層發育中的調節作用，可以推論BCL11A和其他神經元關鍵因子一起參加到皮質形成的重要環節，并與智力發育有著密切聯系。而相關的分子機制還有待進一步實驗證實。

綜上所述，BCL11A對于胚胎神經元發育的具體功能及作為轉錄因子參與皮層發育的具體分子機制仍有待進一步研究。完善BCL11A在皮層發育中的相關研究對于研究和診治智力障礙至關重要。