IL-19/IL-20基因多態性與中國漢族人群結直腸癌易感性的研究*

楊 康，王田甜，孫毅松，冉璐瑤，施松廷，蔣佩文,李 華，楊 平△，李敏惠

1.成都醫學院 基礎醫學院(成都610500)；2.成都醫學院 生物科學與技術學院(成都610500)；3.成都醫學院 檢驗醫學院(成都610500)；4.西部戰區總醫院 腫瘤科(成都610083)；5.成都醫學院 科研實驗中心(成都610500)

近年來，隨著人們生活方式和飲食習慣的改變，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)在我國的發病率和死亡率呈逐年遞增趨勢[1]，預計2020年CRC發病率將達到20.7/10萬[2]。炎癥與CRC發生發展間的密切關系已得到廣泛認可。慢性炎癥被普遍認為是CRC發展中的重要病理成分，炎癥引起的細胞因子和趨化因子的釋放在腫瘤微環境中可調節腫瘤細胞的生長、分化和存活，有助于腫瘤的進展[3]。因此，炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)被認為是誘發CRC的三大高風險誘因之一[4]，且IBD患者發展成為CRC的風險較正常人顯著升高[5]。

遺傳變異如單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)，在CRC易感性中發揮著重要的作用[6]，基于炎癥與CRC的關聯性，炎癥因子基因多態性與CRC易感性研究已成為研究熱點之一。Al Obeed等[7]研究就發現，IL-17基因多態性與中東人群CRC易感性顯著相關，提示炎癥因子的基因多態性可能與CRC易感性密切相關。IL-19/IL-20位于1號染色體q32位置，基于其在基因結構、蛋白質結構和受體方面的相似性，將其劃分為IL-10基因家族，其在炎性疾病中發揮著重要作用[8-9]。在研究IL-20亞家族(IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26)與腸道疾病的關系時，研究[10]結果顯示IL-19和IL-20細胞因子在IBD的發生發展中扮演著重要角色，在潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD)患者中，其表達量顯著升高。同時，研究[11]發現IL-19基因多態性與墨西哥人群UC易感性密切相關，其SNP位點rs2243188和rs2243193可能是墨西哥人患UC的保護因素。該研究團隊還探討了IL-20基因多態性與墨西哥人群UC易感性的關系，結果顯示IL-20基因的2個SNP位點(rs2981573和rs2232360)的GG基因型為UC易感基因型。由于炎癥與許多惡性腫瘤的發生發展有著密切的聯系，因此，探究炎癥相關基因與腫瘤的關系顯得尤為重要。目前關于IL-19/IL-20基因多態性與CRC是否相關聯尚未見報道。因此，本研究選取IL-19/IL-20基因的5個SNP位點進行基因型測定及關聯性分析，探討IL-19/IL-20基因多態性與CRC的關聯性，以明確2個基因遺傳變異在我國漢族人群CRC發生發展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2018年2月至2019年2月西部戰區總醫院收治的94例原發性CRC患者的外周血樣本。通過篩選，所有樣本均來自無血緣關系的漢族人群，94例CRC病例組的篩選標準參照中國醫學會腫瘤學分會制定的《中國結直腸癌診療規范(2017版)》[12]。病例組男52例，女42例，年齡23.0～88.0(55.0±12.8)歲；將同一時期在該醫院體檢中心接受常規檢查且無CRC病史或相關癥狀的94例健康體檢者作為對照組，其中男52例，女42，年齡23.0～88.0(55.0±12.7)歲。本研究經西部戰區總醫院倫理委員會同意，患者簽署知情同意書。在收集樣本的同時對樣本的性別、年齡、病情等臨床資料進行信息編號，并建立相應的數據庫。兩組人群在年齡、性別比例等一般資料方面比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性(表1)。

表1 兩組一般資料比較

1.2 SNP的選擇

從HapMap數據庫中下載中國漢族人群CHB 1號染色體IL-19和IL-20基因區域的數據，利用Haploview軟件進行標簽位點(Tag SNP)的選擇。本研究對這2個基因的SNP位點進行了標簽位點分析，通過設定MAF=0.1，r2閾值為0.8，LOD閾值為3.0來篩選Tag SNP。最后確定了IL-19基因的4個待測位點(rs1028182、rs2243158、rs2243191、rs1798)和IL-20的1個待測位點(rs1400986)。

1.3 研究方法

本研究采用病例-對照一一匹配的實驗方案，即每個病例樣本均有1個性別、年齡、民族和居住地完全相同的健康對照樣本。用標準方法從血液單核細胞中提取基因組DNA，基于SNP stream檢測系統遵循多重PCR引物設計原則設計相應引物，采用SNP stream超高通量基因分型系統針對這5個待測位點對CRC患者(n=94)和匹配的健康對照(n=94)的血液樣本進行基因分型。

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0統計軟件進行數據處理。采用Pearson2goodness-of-fit test檢驗考察試驗所收集的樣本是否符合Hardy-Weinberg平衡。兩組間各SNP位點等位基因型頻率和基因型頻率的分布差異采用Pearson Chi-Square test和邏輯回歸進行檢驗。并通過SNP stats在線平臺確定其單倍型。采用條件邏輯回歸分析方法評價各位點基因型與CRC及CRC臨床資料的關聯性。利用Haploview軟件對IL-19的2個位點進行連鎖不平衡分析，并在軟件中生成LD圖，連鎖不平衡的程度由標準化的D′值來衡量。所選位點的單倍型分析在SNP stats在線平臺上(http://bioinfo.iconcologia.net/snpstats/start.htm)進行。每次分析均計算相應的P值、比值比(OR)及95%可信區間(95%CI)。檢驗水準α除特別說明外均設定為0.05。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗結果

表2 兩組受檢者IL-19/IL-20基因5個多態性位點Hardy-Weinberg平衡分析結果

2.2 IL-19/IL-20基因5個SNP位點多態性分布

表3 兩組IL-19/IL-20基因5個多態性位點等位基因型及基因型分析結果[n(%)]

2.3 IL-19基因4個SNP位點組成的單倍型頻率分布

采用Haploview4.2軟件對IL-19基因4個多態性位點(rs1028182、rs2243158、rs2243191、rs1798)進行連鎖不平衡分析，并用SNP stats在線分析軟件對這4個多態性位點進行單倍型分析，結果顯示：4個位點均呈現不同程度的連鎖不平衡關系，應用SNP stats在線分析軟件共構建5種單倍型。以TGTG單倍型為參考，結果顯示：其余4種單倍型在兩組間分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)(表4、圖1)。

表4 兩組IL-19基因4個多態性位點單倍型分析結果

3 討論

IL-19/IL-20作為IL-10家族的成員，其不僅在機體炎癥反應中發揮重要作用；同時在腫瘤的發生發展中扮演著重要角色。Chen等[13]在IL-19與乳腺癌的關聯性研究中發現，IL-19能直接促進腫瘤的增殖和遷移，為腫瘤細胞生長提供微環境。與之相比，IL-20參與了多種腫瘤的發生發展，如肝癌[14]、前列腺癌[15]和口腔癌[16]等；上述研究結果均顯示，抗IL-20單克隆抗體能有效抑制腫瘤生長，IL-20有望成為治療多種癌癥的新靶點。以上研究提示IL-19/IL-20基因不僅與炎癥疾病密切相關，并且極有可能在CRC及其他類型的惡性腫瘤疾病中也發揮著重要作用。

目前，不少研究揭示炎癥相關基因多態性與CRC易感性存在密切的聯系。Shamoun等[17]發現IL-32基因多態性與CRC易感性有關，其多態性位點rs28372698與IL-32蛋白在CRC組織中的表達上調相關聯。有研究[18]通過遺傳變異闡述了IL-17A基因多態性與CRC的關系，該研究發現IL-17A基因SNP位點rs10484879及該基因的單倍型AGGTG和GAGTG是CRC易感因素。目前，還沒有IL-19/IL-20基因多態性與CRC易感的相關研究，本研究選取IL-19/IL-20作為目的基因，篩選出IL-19基因的4個標簽SNP位點(rs1028182、rs2243158、rs2243191、rs1798)和IL-20基因的1個標簽SNP位點(rs1400986)，但測定結果未發現這5個標簽SNP位點與中國漢族人群CRC易感性相關。本研究同時對IL-19基因的4個多態性位點進行了連鎖不平衡分析，用以探討IL-19基因4個多態性位點所構成的單倍型與CRC易感性的關聯，結果顯示供試基因4個SNP位點所構成的單倍型與CRC易感性無相關性。

值得注意的是，IL-19基因SNP位點rs2243158的相關基因型被發現是兒童患膀胱輸尿管反流的危險因素[19]，但該位點的次等位基因在斑塊型銀屑病的易感性研究中卻提示有顯著的保護作用[20]；同樣的情況也出現在IL-20基因多態性位點rs1400986上，在研究銀屑病易感性基因多態性時，結果顯示，該位點T等位基因的攜帶者是患銀屑病的保護因素，但在幼年特發性關節炎(juvenile idiopathic arthritis，JIA)疾病的研究結果中卻顯示出該位點多態性是患JIA的危險因素[21]。該類研究表明，IL-19/IL-20基因多態性與疾病的相關性在不同研究中存在差異，可能是由于疾病類型、遺傳差異性、樣本人群的不同及研究方法的差異導致；其次，也可能是本研究所選的TagSNP位點未能很好的反映其所在區域的整體情況；亦或者是因為CRC的發病是由多個基因共同調控的，IL-19/IL-20基因作為炎癥相關基因，在調控CRC發病的機制中不占據主要地位。

綜上所述，為深入探究IL-19/IL-20基因多態性位點與CRC的相關性，下一步研究將擴大樣本量和樣本收集范圍，并且收集多種族人群，納入更多IL-19/IL-20基因的功能性SNP位點及相關通路其他基因(STAT、JAK等)的SNP位點，進一步完善CRC發病機制的研究，為臨床預防、診斷、治療CRC提供理論依據。