靶向激活miR-148b-3p對缺血性腦卒中小鼠腦功能的影響及機制*

李 明，劉 勇，董 海，王 彪，閻登富，劉 磊，何仲春

成都醫學院第一附屬醫院 神經內科 (成都 610500)

缺血性腦卒中又稱腦梗死，是由各種原因引起的局部腦組織缺血缺氧性壞死，進而產生對應神經功能缺失的一種腦血管疾病，具有較高的致死率和致殘率。目前臨床上所采用的溶栓、抗血小板聚集、血管介入治療等綜合性措施明顯改善了腦梗死患者梗死灶的血液供應，但血管再通后的缺血-再灌注性損傷也極大影響患者遠期腦功能的恢復[1]。更重要的是，當前缺血性腦卒中在18～50歲成人中的發病率逐年增加，導致越來越多的勞動力缺失，極大地增加了社會負擔[2]。因此，了解缺血性腦卒中發生的分子機制，積極開展新型有效的治療手段，以促進腦梗死患者腦功能恢復和降低其致死率和致殘率，在當前形勢下顯得極為重要。

微型RNA(microRNAs, miRs)是一類由21～25個核苷酸組成的短鏈RNA，主要通過與相應靶基因mRNA的3′段非翻譯區(3′-UTR)相結合而抑制其功能性表達。研究[3-4]顯示，缺血性腦卒中患者血液中miR-148b-3p、miR-151b、miR-27b-3p、miR-20a-5p等多種miRs的含量明顯改變，miR-148b-3p被認為可作為缺血性腦卒中的生物學標記。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體激活是缺血性腦卒中發生的重要機制[5]。在IgA血管炎患者中，miR-148b-3p被證實是炎癥反應的負調控因子[6]。miR-148b-3p是否通過調控NLRP3相關炎癥反應而影響缺血性腦卒中，這一問題尚不清楚。本研究擬在小鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)性腦卒中模型中，探討靶向激活miR-148b-3p對缺血性腦卒中小鼠腦功能的調控作用，以及NLRP3炎癥小體與miR-148b-3p調控腦卒中作用機制的關系，為miRs應用于缺血性腦卒中防治的基礎與臨床研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠(8～10周齡)50只，由成都醫學院實驗動物中心提供。實驗前適應性喂養7 d。光照12 h/d，室內溫度(21～22)℃，濕度40%～55%，自由進食進水。

1.1.2 主要藥品及試劑 水合氯醛(批號：C8383)、NLRP3抑制劑MCC950(批號：5381200001)、氯化三苯基四氮唑(TTC，批號：T8877)購自美國Sigma-Aldrich公司；TrizolTMPlus RNA純化試劑盒(批號：12183555)、SuperScript Ⅲ逆轉錄酶(批號：18080044)購自美國Invitrogen公司；miR-148b-3p引物、U6引物來自美國Invitrogen公司；miR-148b-3p agomiR和agomiR陰性對照品來自上海吉瑪制藥技術有限公司；RIPA裂解液(批號：P0013B)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：P0010S)購自上海碧云天公司；抗硫氧還蛋白互作蛋白(TXNIP，批號：NBP1-54578SS)購自美國Novus Biologicals公司；NLRP3(批號：sc-25778)購自美國Adipogen生命公司；GAPDH(批號：sc-365062)抗體、過氧化物酶連接的羊抗兔二抗IgG(批號：sc-2004)購自美國Santa Cruz公司。

1.2 動物模型制作

參照文獻[7]方法制作MCAO性腦梗死模型：術前禁食6 h，采用10%水合氯醛按0.3 g/kg體重腹腔注射麻醉，仰臥位固定，消毒后，頸前正中切開，暴露左側頸總動脈、頸內動脈及頸外動脈，游離頸內、頸外動脈分叉處，結扎頸總動脈近心端和頸外動脈根部，用動脈夾夾閉頸內動脈，在頸總動脈靠近動脈分叉處穿線備用，在備用線以下剪一小口，將頭端鈍化的2 cm 6-0號尼龍栓線從切口插入頸總動脈，繼續插入拴線至頸內動脈上動脈夾處，松開動脈夾，繼續推進尼龍拴線直至顱內，遇阻力而停止，此時栓線插入深度距動脈分叉處達1 cm左右，栓線頭剛好到達并封閉大腦中動脈。然后，結扎頸總動脈處備用的結扎線，依次分層縫合切口，拴線另一端暫時保留在體外。術后切口消毒，監測其呼吸、體溫、心率。栓塞90 min后，拔去拴線以實現再灌注；再灌注72 h后，處死動物，取材檢測。

1.3 動物分組處理

將50只雄性C57BL/6小鼠按照隨機數字表法分為假手術組(Sham組)、栓塞模型組(MCAO組)、NLRP3抑制劑組(MCC950組)、miR陰性對照轉染組(NC agomiR組)、miR-148b-3p激動劑轉染組(miR-148b-3p agomiR組)，每組10只。假手術組的手術過程只進行至暴露頸內動脈。其他4組按照上述過程完成MCAO模型建立及隨后的再灌注。手術后即刻，MCC950組腹腔注射50 mg/kg體重的MCC950，Sham組、MCAO組腹腔注射與MCC950組同等容積的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)。

miR陰性對照轉染組、miR-148b-3p激動劑轉染組在執行MCAO模型前60 min通過側腦室注射給予agomiR陰性對照品或miR-148b-3p agomiR。側腦室注射miR-148b-3p agomiR的方法參考文獻[8]。小鼠經10%水合氯醛(0.3 g/kg體重)腹腔注射麻醉，俯臥位固定腦立體定位儀(瑞沃德，深圳)上，頭部75%乙醇消毒，正中切開皮膚，暴露顱骨。找出并標記注射進針點(前囟0.58 mm，腹側2.1 mm，左側1.2 mm)，在進針點處鉆孔，植入套管，直至左側腦室。將miR-148b-3p agomiR(30 pmol/g體重)或agomiR陰性對照品(30 pmol/g體重)與DOTAP脂質轉染試劑按100 pmol∶1 μL比例混合為6 μL液體，在37 ℃下孵育15 min后，利用微量注射器將此混合液在20 min內注入左側腦室，留針10 min，緩慢拔去微量注射器。縫合頭部皮膚，將小鼠由立體定向儀移下，放入恒溫恒濕的孵育箱中，37 ℃下保溫60 min；再完成MCAO模型制作。

1.4 腦功能缺陷評分

再灌注72 h時按照Vemuganti等[9]方法，采用5分制評估小鼠腦功能缺陷程度：0分，無任何腦功能缺陷(正常)；1分，不能正常伸展右前肢(輕度缺陷)；2分，肢體向右側轉圈彎曲(中度缺陷)；3分，行走時向右側傾倒(重度缺陷)；4分，不能自發行走(極重度缺陷)；5分，意識障礙。

1.5 腦梗死灶體積測定

再灌注72 h后，小鼠在10%水合氯醛腹腔注射麻醉下斷頭處死，快速取腦組織，做冠狀切片(每片厚度1.5 mm)。切片放置于2%氯化三苯基四氮唑(TTC)中37 ℃下孵育15 min，將染色后的腦片置于掃描儀中掃描，圖片存儲后采用Image pro plus軟件對腦片中梗死體積進行分析。腦梗死體積百分數參照文獻[10]計算。

1.6 RT-PCR分析

再灌注72 h后，小鼠斷頭處死，快速分離梗死區周圍腦皮質組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，經SuperScript Ⅲ逆轉錄酶逆轉錄合成cDNA，采用以下引物序列進行擴增：miR-148b-3p引物序列5′-CTCACATGGTGTCGTGGAGTCGG CTTAACAGTTGAGTACCAAGTT-3′；內參U6引物序列5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。擴增反應條件包括95 ℃ 10 min，40個循環的95 ℃15 s、60 °C 1 min。采用2-△△Ct法做相對半定量分析，以表達量比值miR-148b-3p/U6作為miR-148b-3p的相對表達量。

1.7 蛋白質印跡技術分析

再灌注72 h后，小鼠斷頭處死，快速分離梗死區周圍腦皮質組織，采用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量。每泳道40 μg蛋白經8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉液室溫下阻斷2 h，PVDF膜經抗TXNIP、NLRP3、GAPDH一抗于4 ℃孵育過夜，過氧化物酶連接的羊抗兔二抗IgG于室溫孵育1 h。最后，加化學發光試劑顯示目的蛋白條帶。采用ImageJ軟件檢測蛋白條帶光密度，并做統計分析。

1.8 熒光素酶實驗

利用starBase V2.0在線數據庫(http://starbase.sysu.edu.cn/)預測TXNIP mRNA上的miR-148b-3p調節靶點[11]。采用定點突變試劑盒(GeneTailor Site-Directed Mutagenesis System, Invitrogen公司)誘使TXNIP 3′-UTR的miR-148b-3p結合位點發生突變，產生突變型TXNIP 3′-UTR。將野生型TXNIP 3′-UTR或突變型TXNIP 3′-UTR克隆入pRL-CMV載體(美國Promega公司)。將小鼠神經瘤母細胞N2a細胞系以0.5×105個/孔密度接種于96孔板。讓細胞共轉染野生型TXNIP 3′-UTR或突變型TXNIP 3′-UTR的熒光素酶構建物和miR-148b-3p模擬物(上海吉瑪制藥技術有限公司)。轉染48 h后，各孔加入雙熒光素酶檢測底物試劑(美國Promega公司)，檢測數據。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠缺血性腦卒中時miR-148b-3p/ TXNIP/NLRP3軸的表達變化

為驗證miR-148b-3p/TXNIP/NLRP3軸在小鼠缺血性腦卒中的可能作用，本研究首先檢測了缺血區腦組織中miR-148b-3p/TXNIP/NLRP3的表達量。MCAO組小鼠患側大腦皮層表現出典型梗死灶，Sham組小鼠皮層則無明顯異常。各組腦組織中TXNIP和NLRP3蛋白的代表性電泳條帶如下(圖1)。與Sham組相比，MCAO組腦組織中miR-148b-3p表達明顯降低，TXNIP、NLRP3蛋白表達量則明顯增多(表1)。

表1 各組小鼠缺血區腦組織miR-148b-3p、TXNIP、NLRP3表達比較

2.2 激活miR-148b-3p對缺血性腦卒中小鼠腦組織TXNIP/NLRP3軸表達的影響

為驗證炎癥反應與miR-148b-3p保護小鼠缺血性腦卒中的關系，本研究觀察了miR-148b-3對缺血區腦組織TXNIP、NLRP3表達的影響。與Sham組相比，MCAO組小鼠腦組織TXNIP、NLRP3蛋白表達量均顯著增大，提示患病小鼠腦組織炎癥反應存在；與NC agomiR組相比，miR-148b-3p agomiR組腦組織TXNIP、NLRP3蛋白表達量均顯著降低(表1)。

為進一步探討miR-148b-3p與TXNIP的關系，采用starBase V2.0在線數據庫預測到TXNIP mRNA上的miR-148b-3p調節靶點。采用熒光素酶實驗驗證miR-148b-3p對TXNIP mRNA的靶向調節作用。在轉染野生型TXNIP 3′-UTR載體時，與空白對照(Wt-TXNIP+NC miR)組相比，miR-148b-3p模擬物明顯降低了轉染野生型TXNIP 3′-UTR載體下的熒光素酶活性。而在轉染突變型TXNIP 3′-UTR載體時，miR-148b-3p模擬物并未改變轉染突變型TXNIP 3′-UTR載體下的熒光素酶活性(表2)。

表2 各組N2a細胞熒光素酶活性比較(分，

2.3 激活miR-148b-3p/NLRP3軸對缺血性腦卒中小鼠腦功能評分及腦梗死灶體積的影響

miR-148b-3p激動劑(miR-148b-3p agomiR)用于小鼠缺血性腦卒中模型，以觀察激活miR-148b-3對其腦功能缺陷評分及腦梗死灶體積的影響。與Sham組相比較，MCAO組小鼠腦功能缺陷評分和腦梗死灶體積均顯著增大，提示患病小鼠腦部結構與功能顯著受損；與NC agomiR組相比，miR-148b-3p激動劑(miR-148b-3p agomiR)轉染組腦功能缺陷評分明顯降低，腦梗死灶體積顯著縮小。NLRP3抑制劑MCC950用于小鼠缺血性腦卒中模型，以驗證NLRP3相關炎癥反應在缺血性腦卒中發生中的作用。與MCAO組相比較，MCC950組小鼠腦功能缺陷評分明顯降低，腦梗死灶體積明顯縮小(表3)。

表3 各組小鼠腦功能缺陷評分及腦梗死灶體積百分數比較

3 討論

研究[12]表明，miRs廣泛表達于真核生物體內，盡管在進化上高度保守，但功能上miRs在細胞分化、機體發育及疾病發生發展過程可能發揮著巨大作用。在患有缺血性腦卒中的患者與動物體內，多種miRs的表達量發生了顯著性改變[3,13]。一些miRs(miR-151b、miR-27b-3p等)的表達明顯上調，而另一些miRs(miR-148b-3p等)則顯著下調。下調的miR-148b-3p可視作缺血性腦卒中發生的生物學標記[3]。但miR-148b-3p在缺血性腦卒中發生機制中的作用并不清楚。為此，本研究在小鼠缺血性腦卒中疾病模型中觀察了缺血區腦組織miR-148b-3p表達量的變化及其與小鼠缺血性腦卒中發生的關系。結果顯示，在腦卒中小鼠的缺血區腦組織中miR-148b-3p表達量顯著下調，而側腦室給予miR-148b-3p激動劑預處理明顯縮小了患病小鼠的腦梗死灶體積，改善了腦功能缺陷，提示內源性miR-148b-3p的表達下調可能與小鼠缺血性腦卒中發生相關，激活miR-148b-3p則對小鼠缺血性腦卒中及其腦功能缺陷有明顯保護性作用。

研究[14]顯示，氧化應激反應在缺血性腦卒中發生機制中起重要作用。氧自由基的產生，可促進TXNIP與內源性抗氧化物硫氧還蛋白分離，隨后TXNIP通過與NLRP3結合而激活NLRP3炎癥小體形成[15]。NLRP3炎癥小體在結構上包括核心部分NLRP3、接頭蛋白ASC和caspase-1前體。NLRP3炎癥小體激活后可通過caspase-1激活而促進IL-1β等炎性因子前體的裂解、成熟和釋放，誘導細胞損傷。盡管研究[16-17]顯示，miR-148b-3p可調節神經膠質中施萬細胞的的遷移活動和神經膠質瘤細胞的惡性生物學行為，但miR-148b-3p保護缺血性腦卒中小鼠腦損傷的具體信號機制并不清楚。本研究通過觀察激活miR-148b-3p對腦卒中小鼠腦組織NLRP3及其上游分子TXNIP表達的影響，以探討NLRP3炎癥反應與miR-148b-3p保護小鼠缺血性腦卒中作用機制的關系。結果顯示，缺血性腦卒中導致小鼠缺血區腦組織中NLRP3、TXNIP的蛋白表達上調，而側腦室給予miR-148b-3p激動劑預處理在改善腦卒中小鼠腦功能損傷的同時還顯著下調TXNIP、NLRP3的蛋白表達；應用NLRP3抑制劑MCC950也明顯改善腦卒中小鼠的腦損傷；同時，采用熒光素酶實驗驗證miR-148b-3p對TXNIP mRNA的靶向調節作用，結果證實TXNIP應該是miR-148b-3p的一個直接調節靶。

綜上所述，激活miR-148b-3p對小鼠缺血性腦卒中的保護性作用機制可能與其抑制促炎性TXNIP/NLRP3信號軸有關。