亞麻木酚素通過調控TXNIP/NLRP3信號通路改善CIH小鼠心肌損傷

任 靜，郭亞凈，劉 寒，周 健，吉恩生

(河北中醫學院基礎醫學院生理教研室，低氧生理與病理生理實驗室,河北 石家莊 050020)

阻塞性睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnea，OSA)主要表現為夜間睡眠過程中反復出現的上氣道不完全或完全阻塞[1]。其特有的病理過程慢性間歇性低氧(chronic intermittent hypoxia，CIH)，是引發心血管疾病的獨立危險因素[2]。近年來國內外研究證實，氧化應激是在眾多心血管疾病中的主要因素，如心肌肥大、心力衰竭、動脈粥樣硬化和缺血性心臟病[3]。有研究表明，與間歇性低氧缺氧/再氧合過程類似的心肌缺血/再灌注損傷誘發心肌細胞氧化應激，大量產生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)促使硫氧還蛋白結合蛋白(thioredoxin interaction protien，TXNIP)與核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3( the pyrin domain containing 3，NLRP3) 相互結合，并激活NLRP3受體，促進NLRP3炎性復合體形成，激活半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase-1)，進而使白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素18(interleukin-18，IL-18)等炎性因子表達水平升高，進而造成小鼠心肌損傷[4-6]。

亞麻木酚素 (secoisolariciresinol diglucoside，SDG)為亞麻籽的主要生物成分，其含量約為其他植物的75～800倍[7]。SDG具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗血小板聚集、抗癌以及清除自由基的作用[1]。有研究證明，在離體缺血/再灌注模型中，SDG具有促進血管生成和抗凋亡的特性，起到心臟保護作用[8]。且研究顯示，SDG可以直接清除自由基，抑制ROS的生成[9]。因此，本研究探討SDG是否通過調控ROS-TXNIP-NLRP3信號通路，從而改善CIH誘發的小鼠心肌損傷，旨在為臨床防治OSA提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物健康成年♂ C57BL/6小鼠18只，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號:SCXK[京]2016-0006。動物飼料購自江蘇協同醫藥生物工程股份有限公司。動物在特定的無致病性條件下飼養，12 h光照/12 h暗周期，自由飲水，室內溫度控制在(25±1) ℃。

1.2 主要試劑與設備

1.2.1主要藥品與試劑 SDG(愛必信生物科技有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ELISA檢測試劑盒TNF-α、IL-6、IL-1β(武漢華美生物工程有限公司)；抗TXNIP、抗NLRP3、抗caspase-1、抗IL-1β和抗IL-18抗體(ABclonal公司)；抗含CARD的凋亡相關顆粒樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)抗體(Abcam公司)；兔抗鼠Tublin單克隆抗體(武漢賽維爾生物科技有限公司)；Tween-20、PIPA裂解液和苯甲基磺氟(phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF)(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2.2儀器設備 CIH氧艙(Oxyeycler Model 84，BioSpherix公司，美國)；正置顯微鏡(DMEB，Leica公司，德國)；全自動酶標分析儀(EPOCH，Thermo Fisher公司，美國)；多功能成像系統(Vilber Fusion FX5 Spectra，Vilber Lourmat，法國)

1.3 主要方法

1.3.1造模與分組 將C57BL/6小鼠(n=6)隨機平均分為3組：常氧組、CIH組和CIH+SDG組。小鼠自由飲食，適應性飼養1周，在日間進行造模。將CIH組和CIH+SDG組小鼠置于CIH艙中，前1.5 min向艙內充入100%氮氣，使氧氣濃度降至9%，后1.5 min充入純氧，使氧氣濃度升至21%，每一循環3 min。與此同時，將常氧組置于相同規格的艙內，但向艙內沖入空氣。每天8 h(9 AM～5 PM)上艙，每周7 d，持續5周，共35 d。每天造模前，CIH+SDG組給予SDG溶液灌胃(用藥量30 mg·kg-1)，以藥理研究方法學的小鼠與臨床人用藥量折算方法折算，CIH與常氧組灌服同等體積的生理鹽水。

1.3.2動物標本采集 ① 一般信息采集：每天觀察小鼠行為和生理變化，造模35 d后，取材前，稱量小鼠體質量(body weight,BW)。② 血液采集：造模35 d后，1%戊巴比妥鈉，按體重100 μL·g-1，腹腔注射。并進行目內眥取血，存放于促凝管中，室溫放置30 min后，4 ℃、1 500 r·min-1、離心15 min后取上清液置于-80 ℃保存。③ 造模結束(35 d)后，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，小鼠仰臥位固定于手術操作板上，暴露胸腔。迅速摘取心臟并移去多余組織，并稱心臟質量(heart weight，HW)，計算小鼠心臟質量(HW)/體質量(BW)的比值。心臟組織，用生理鹽水沖洗，放于無菌無酶凍存管內，置于-80 ℃保存，待Western blot檢測。心尖放于4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。

1.3.3小鼠心肌損傷情況檢測 HE染色，光鏡下觀察各組小鼠心肌組織病理學變化，每張切片隨機選取4個視野進行拍照。檢測各組小鼠血清生化指標LDH、CK的水平，按照試劑盒說明書檢測。

1.3.4TBA、NBT法檢測心肌組織中氧化應激指標 取小鼠心肌組織勻漿，離心后取上清檢測MDA、SOD含量，按照試劑盒說明書進行操作。

1.3.5酶聯免疫吸附測定(ELISA)法測定小鼠血清中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量 用ELISA法測定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量，促凝血3 000～4 000 r·min-1，離心10 min，取上清，4℃冰箱存放，待測。

1.3.6Western blot檢測小鼠心肌組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β的蛋白表達情況 小鼠心肌組織20 mg左右，每100 mg組織加入裂解緩沖液(磷酸蛋白酶抑制劑A ∶B ∶cocktail ∶PMSF=1 ∶1 ∶2 ∶1)1 mL置于冰上，隨之進行機械破碎和超聲破碎，使組織充分裂解。12 000 r·min-1、4 ℃、離心15 min，取上清。采用BCA法進行蛋白樣定量，測好蛋白濃度后根據蛋白樣體積：4×buffer=3 ∶1的比例加入4×buffer，剩余用水補充，上樣量至10 μL。封口，于沸水中煮沸5 min，使蛋白充分變性，-20 ℃保存備用。

2 結果

2.1 亞麻木酚素對CIH小鼠心肌損傷的改善作用

2.1.1亞麻木酚素對CIH小鼠心肌組織病理學表現的影響 HE染色結果，常氧組小鼠心肌細胞排列整齊，胞核居中，呈完整的圓形或橢圓形，胞間內無水腫，未見心肌纖維化等明顯的病理損傷；CIH組小鼠心肌細胞排列紊亂，胞核壞死，細胞明顯腫脹，胞間隙增大，嚴重顆粒變性、空泡變性，同時還有炎癥細胞浸潤，心肌纖維斷裂溶解、壞死，纖維化等病理改變；CIH+SDG組與CIH組相比，心肌組織纖維化程度明顯減輕，細胞形態大致完整，見Fig 1。從病理切片來看，CIH對心肌細胞造成了實質性損傷，此外，亞麻木酚素可以明顯減輕CIH誘導的小鼠心肌損傷。

Fig 1 HE staining of mouse myocardium in each groupA:control;B:CIH;C:CIH+SDG

2.1.2亞麻木酚素對CIH小鼠心質量/體質量比值的影響 3組小鼠造模完成后的心質量/體質量比值計算結果。可見CIH處理組小鼠心質量低于常氧組，CIH組小鼠體質量明顯低于常氧組(P<0.01)，而與常氧組相比CIH處理組小鼠心質量/體質量比值明顯升高(P<0.05)，給予SDG后小鼠心質量/體質量比值下降(P<0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Comparison of heart weight,body weight,heart weight / body weight of mice in each

2.1.3亞麻木酚素對CIH小鼠血清生化指標的影響 與常氧組相比，CIH組血清中LDH、CK的濃度明顯升高(P<0.01)，而CIH+SDG組與CIH組相比明顯降低(P<0.05)，見Tab 2。說明CIH造成了心肌細胞的破壞，LDH、CK釋放入血，亞麻木酚素處理組小鼠血清中LDH、CK明顯減低。

Tab 2 Measurement results of LDH and CK concentrations in mouse

2.2 亞麻木酚素對CIH小鼠心肌氧化應激的作用分別檢測3組小鼠心肌組織勻漿中MDA、SOD的含量。與常氧組相比，CIH組小鼠心肌組織中MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD含量明顯降低(P<0.01)。SDG干預可見MDA含量明顯下降(P<0.05)，SOD含量明顯升高(P<0.01),見Tab 3。說明CIH可以引起小鼠心肌氧化應激，且給予SDG后改善了CIH小鼠誘導的氧化應激。

Tab 3 Contents of MDA and SOD in myocardial tissues of rats in each

2.3 亞麻木酚素對CIH小鼠心肌炎癥的作用

2.3.1亞麻木酚素對CIH小鼠血清中炎性因子的影響 3組炎癥因子的比較，CIH組與常氧組相比，血清中TNF-α、IL-6、IL-1β均明顯升高(P<0.05)，而CIH+SDG組與CIH組相比TNF-α有非常明顯的下降(P<0.01)，IL-6明顯下降(P<0.05)，IL-β含量降低，見Tab 4。這說明CIH可造成小鼠血清中炎癥因子升高，給予SDG后可以改善CIH誘導的小鼠全身性炎癥反應。

Tab 4 Measurement results of serum inflammatory factors TNF-α,IL-6 and IL-1β in

2.3.2Western blot檢測TXNIP、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β蛋白表達情況

2.3.2.1SDG對CIH小鼠心肌組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-18和IL-1β蛋白表達情況的影響 結果見Fig 2，模型組與常氧組相比，小鼠心肌中TXNIP、NLRP3炎性小體(NLRP3、caspase-1和ASC)蛋白表達均明顯升高(P<0.05)，給藥組與模型組相比，TXNIP、NLRP3炎性小體(NLRP3、caspase-1和ASC)蛋白的表達均明顯下降(P<0.05)。

Fig 2 The protein expression levels of TXNIP and NLRP3 inflammasomes in myocardial tissuesdetected byWestern blot in each *P<0.05,**P<0.01 vs control;#P<0.05,##P<0.01 vs CIH

2.3.2.2SDG對CIH小鼠心肌組織中炎性因子IL-18和IL-1β蛋白表達情況的影響 結果見Fig 3，模型組與常氧組相比，IL-18、IL-1β蛋白表達明顯升高(P<0.01)，給藥組與模型組相比，IL-18明顯降低(P<0.01)，IL-1β蛋白表達降低。

Fig 3 Expression of IL-18 and IL-1β protein in myocardial tissuesdetected by Western blot in each **P<0.01 vs control;##P<0.01 vs CIH

3 討論

OSA是一種常見的慢性睡眠呼吸障礙性疾病，全球2%的中年女性和4%的男性受其影響[10]。現代醫學對OSA一般采用藥物治療、口腔矯治器治療、呼吸機持續氣道正壓通氣治療、外科手術治療等。然而到目前為止，各種治療措施療效不十分理想。姚亮等根據中醫理論將鼾癥分為肺脾氣虛型、血虛性、腎陰虛行、腎陽虛型，其中臨床上以肺脾氣虛證常見[11]。《本草圖經》《本經逢原》《滇南本草》等醫籍中提到亞麻籽 “味甘辛、性平、無毒，具有補虛、補陰、養血祛風” 的作用。現代研究中表明亞麻籽提取物SDG具有心血管保護作用[12-13]，且具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗血小板聚集、抗癌以及清除自由基的作用[1]。

CIH作為OSA的主要病理特征[14]，是引發包括心室重構、心肌缺血、心力衰竭在內的心肌損傷的獨立危險因素。近年來有研究證實[15]，與間歇性低氧缺氧/再氧合過程類似的，心肌缺血/再灌注損傷導致氧化應激并產生大量的ROS釋放，促使 TXNIP 與 NLRP3 相互結合激活心肌組織中NLRP3炎性小體促使IL-1β、IL-18表達水平升高，降低心臟功能，擴大梗死面積。然而，CIH是否通過ROS-TXNIP-NLRP3信號通路誘發心肌損傷，以及SDG是否通過調節ROS-TXNIP-NLRP3信號通路改善CIH誘發的小鼠心肌損傷目前尚不清楚。此外，氧化應激反應在CIH 誘發的心肌損傷中起著關鍵作用，一般通過檢測脂質過氧化物的終產物MDA以及SOD反映氧化應激水平以及細胞損傷程度[15]。其中TXNIP在無應激狀態時，TXNIP是抗氧化劑硫氧還蛋白(thioredoxin-1，Trx-1)的負調節因子，TXINP與Trx在胞核內結合。而在氧化應激條件下，Trx1-TXNIP復合物解離，TXNIP從胞核轉位到胞質，進而與NLRP3受體結合并活化NLRP3受體，促進NLRP3炎性小體形成[6,16]。將小鼠暴露于間歇性低氧環境中35 d 后，監測到其MDA水平較正常對照組明顯增加，其SOD水平明顯下降，心肌組織中TXNIP蛋白表達明顯升高。給予SDG后，與CIH組相比，MDA水平下降，SDG水平有所上升，心肌TXNIP蛋白表達降低。以上結果顯示，CIH可以引起小鼠心肌氧化應激及TXNIP蛋白的表達升高，給予SDG后改善了CIH小鼠誘導的氧化應激反應，提示SDG可通過抑制ROS的產生從而減弱TXNIP在心肌組織中的表達。其中NLRP3炎性小體是由NLRP3、銜接蛋白ASC(凋亡相關的斑點樣蛋白)和pro-caspase-1組合而成的一種多蛋白復合體，在細胞碎片和微生物產物等促炎因子刺激下組裝而成，其可觸發固有免疫防御并且與無菌的炎癥反應有關。NLRP3炎性小體可通過活化caspase-1誘導促炎因子IL-1β和IL-18的成熟、釋放，從而引起組織炎癥反應[17]。我們研究發現，CIH 小鼠心肌組織中NLRP3炎性小體、IL-1β和IL-18蛋白表達增多，SDG可使CIH小鼠NLRP3炎性小體、IL-1β和IL-18蛋白表達降低，減輕了CIH小鼠心肌損傷。這些結果均表明SDG可通過調節ROS-TXNIP-NLRP3信號通路改善了CIH誘導的小鼠心肌損傷。