蘿卜硫素對膿毒癥小鼠心肌損傷的保護作用及機制研究

李云鵬,楊玉丹,郭勝存,程 棟,湯 毅

(鄭州大學第一附屬醫院 1.心血管內科、2.腫瘤內科，河南 鄭州 450052)

膿毒癥(sepsis)是機體對感染反應失調而出現組織灌注不足、低血壓及伴有危及生命的器官功能障礙。死亡率高，治療效果差，是急危重癥醫學面臨的主要臨床問題，隨著各種醫療技術及治療方法的進步，膿毒癥的病死率已有明顯下降，但其對醫學界仍然是一個挑戰[1]。膿毒癥發展過程中的心臟功能障礙(sepsis-induced yocardial dysfunction，SIMD)是嚴重膿毒癥的特征之一，是膿毒癥患者死亡增加的主要原因，且心血管功能障礙導致患者生活質量下降，預后不良[2]。此外，膿毒癥的發病機制仍不清楚，炎癥假說曾被認為是膿毒癥的發生發展的主要原因，但抗感染治療結果卻不盡如人意。有研究發現，凋亡和應激均是膿毒癥重要的發病機制。所以，探索有效的治療藥物改善膿毒癥引起心功能障礙，對于改善膿毒癥預后具有重要的臨床和社會意義。

蘿卜硫素(sulforaphane，SFN)是一種天然存在的異硫氰酸酯衍生物，能夠誘導機體分泌II型解毒酶，在不同的研究中證實具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤以及心血管保護的作用[3-5]。但是，SFN對于膿毒癥心肌損傷是否同樣具有保護作用，目前尚不可知。本研究擬通過盲腸結扎穿孔建立膿毒癥心肌損傷模型，觀察SFN對膿毒癥小鼠心肌損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑蘿卜硫素(Sigma-Aldrich,USA，貨號：S6317-5mg)；肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(Biovision，USA)；二氫乙錠(dihydroethidium，DHE)試劑盒(Invitrogen，USA)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平(江蘇凱基生物，中國)，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性檢測試劑盒(上海碧云天，中國)；原位末端凋亡TUNEL檢測試劑盒(Roche，瑞士)；GAPDH內參抗體(Santa Cruz，USA)；Bax、Caspase-3及Bcl-2抗體(Abcam，英國)。

1.2 實驗動物健康C57BL/6小鼠，♂,體質量(25±5) g，購買自鄭州大學實驗動物中心，生產許可證號：SYXK(豫)2019-0002。所有動物實驗均嚴格遵守鄭州大學動物倫理保護指導進行。

1.2.1動物模型的構建 參考既往文獻[4]，通過盲腸結扎和穿刺(cecal ligation and puncture，CLP)誘導小鼠膿毒血癥。具體操作流程如下：造模前禁食24 h以確保各組小鼠腸內容物一致，使用戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)給予腹腔注射麻醉；用脫毛膏脫除小鼠腹部毛發；沿腹中線切口暴露盲腸，用22號針刺穿刺回盲瓣下方2次，擠壓腸內容物后將盲腸還納回腹腔，縫合。假手術組及單純SFN組，僅給予盲腸暴露，但不給予盲腸結扎及穿刺，其余步驟同實驗組。

1.2.2實驗分組及給藥方式 將實驗小鼠按照實驗設計，應用隨機數字法平均分為4組，每組10只，(1)假手術組(Sham)：實驗小鼠僅給予盲腸暴露，不結扎穿刺，腹腔注射溶劑DMSO (0.5 mg·kg-1)；(2)單純SFN處理組(SFN)：給予盲腸暴露，不結扎穿刺，腹腔注射溶解于DMSO中的SFN (0.5 mg·kg-1)；(3)盲腸結扎穿孔組(CLP)：實驗小鼠給予盲腸結扎穿孔模型制作之后，腹腔注射溶劑DMSO (0.5 mg·kg-1)；(4)盲腸結扎穿孔+SFN處理組(CLP+SFN)：盲腸結扎穿孔模型制作后給予腹腔注射溶解于DMSO中的SFN (0.5 mg·kg-1)。

1.3 心臟功能檢測造模24 h后，脫去小鼠胸前毛發，用VEVO 2100(VisualSonics Inc，加拿大)小動物超聲儀行M型超聲心動圖，給予測量及記錄左心室舒張末內徑(LVEDD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)數據，然后再計算左心室短軸縮短率(LVFS)和左心室射血分數(LVEF)，用以評估左心室收縮功能。

1.4 血清CK和LDH水平檢測造模24 h后，應用1 mL注射器穿刺左心室采取血液標本，應用離心機以3 000 r·min-1離心10 min后，收集上清液，之后標本放置于-80 ℃冰箱冷凍保存。應用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中LDH 和CK 活性。

1.5 心肌組織活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量檢測造模24 h后，用預冷的PBS洗滌心臟，在-80 ℃冷凍后，切成5 mm厚度組織切片。然后，用DHE和DAPI染料對組織切片進行染色。用全自動倒置熒光顯微鏡(Leica，DMI6000B)拍攝熒光圖片，應用軟件Image-Pro Plus測定熒光。

1.6 心肌組織SOD活性、GSH-Px活性以及MDA水平檢測造模24 h后，迅速取下心臟，用生理鹽水(1 ∶9)制備蛋白勻漿。按照說明書分別檢測心肌組織中抗氧化酶SOD和GSH-Px活性以及脂質過氧化產物MDA含量。

1.7 心肌組織原位末端染色法(TUNEL)檢測造模24 h后取心臟，放入4%多聚甲醛固定溶液中12 h，石蠟包埋、制備切片，根據TUNEL說明書進行操作，最后在暗室中應用熒光顯微鏡拍照。計算凋亡指數/%=視野內的綠色熒光(凋亡的細胞核)的數目/藍色熒光(心肌細胞核)的數目×100%。

1.8 凋亡調節蛋白Bax，Caspase-3和Bcl-2表達測定造模24 h后取心臟，在冰上切取大小質量一致的心肌組織塊，然后在研缽內研碎，之后置入EP管，再加入裂解液在冰上進行裂解20 min，于4 ℃條件12 000 r·min-1離心20 min，最后煮沸。蛋白質樣品制備后給予電泳、轉膜、牛奶封閉后于4 ℃孵育抗Bax(1 ∶1 000)、Bcl-2(1 ∶500)、Caspase-3(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶8 000)一抗，過夜；繼而室溫孵育相應二抗(1 ∶8000) 2 h。使用LAS500超靈敏化學發光成像儀檢測蛋白質條帶，使用ImageJ軟件進行定量分析。

2 結果

2.1 SFN處理改善膿毒癥小鼠心肌損傷如Fig 1所示，與Sham組相比，CLP組小鼠血清CK和LDH活性均顯著升高，表明膿毒癥導致心肌損傷(P<0.05)，而給予SFN處理后(CLP+SFN組)，CK和LDH活性則明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與Sham組相比，單純SFN組的CK和LDH活性變化不明顯，差異無統計學意義(P>0.05)。

Fig 1 Effect of SFN treatment on CK and LDH activity in sepsis n=6)#P<0.05 vs Sham;*P<0.05 vs CLP.

2.2 SFN處理改善膿毒癥小鼠的心臟左心室功能如Tab 1所示，CLP組小鼠與Sham組比較，LVEDD和LVESD顯著增高，而LVFS與LVEF顯著降低，表明膿毒癥導致心腔擴張，心臟功能受損，各組間差異明顯(P<0.05)。與CLP組相比，CLP+SFN組可以提高LVEF與LVFS，降低LVEDD和LVESD(P<0.05)。與Sham組相比，單純SFN組對小鼠心功能無明顯影響(P>0.05)。

Tab 1 Effects of SFN treatment on heart function in different n=6)

2.3 SFN對膿毒癥小鼠心肌氧化應激反應的影響如Fig 2所示，與Sham組比較，盲腸結扎穿刺造模之后，CLP組小鼠ROS含量與MDA水平明顯升高，而SOD和GSH-Px活性明顯降低，表明膿毒癥致使心肌氧化應激反應增強，各組間差異有顯著性(P<0.05)。與CLP組相比，CLP+SFN組可以降低ROS含量與MDA水平，增強SOD活性和GSH-Px活性(P<0.05)。與Sham組相比，單純SFN組不影響心肌氧化應激反應(P>0.05)。

Fig 2 Effects of SFN on myocardial oxidative #P<0.05 vs Sham;*P<0.05 vs CLP

2.4 SFN抑制膿毒癥小鼠心肌組織凋亡與Sham組比較，盲腸結扎穿刺后的CLP組小鼠心肌組織凋亡指數升高。而CLP+SFN組與CLP組相比，心肌凋亡指數則表現為降低(P<0.05)。而單純SFN組與Sham組比較，兩組間凋亡指數則差異無統計學意義(P>0.05)(Fig 3A，3B)。

同時，我們也檢測了凋亡相關蛋白的表達水平，進一步驗證上述結論。如Fig 3C,3D所示，盲腸結扎穿刺造模后，CLP組小鼠與Sham組比較，心肌組織促凋亡蛋白Bax及Caspase 3表達水平呈現為明顯升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2則表現為顯著下降，兩者差異具有統計學意義(P<0.05)。而CLP+SFN組與CLP組相比，則表現為SFN能減弱促凋亡蛋白Bax、Caspase-3的表達水平，并增強抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平，且差異有顯著性(P<0.05)。與Sham組相比，單純SFN組對小鼠心肌組織的相關凋亡蛋白表達水平則無明顯影響(P>0.05)。

3 討論

膿毒癥是一種伴有感染的全身多系統疾病，是感染死亡的主要原因，臨床常見多發，死亡率可高達25%，若發展為敗血癥休克并累及心功能障礙，死亡率可高達90%[6-7]。膿毒癥發病過程中伴發的心功能障礙是膿毒癥多器官功能衰竭的重要特征，常成為促使膿毒癥患者死亡的關鍵因素。而有研究表明，氧化損傷可引起細胞凋亡，導致膿毒癥心肌損傷加重[8-9]。因此，尋找能有效減輕膿毒癥心肌損傷的藥物，是目前我們面臨的重要問題。蘿卜硫素是一種多功能酶誘導物，在不同的疾病模型研究中，表明其可以有效地預防癌癥，具有抗氧化、抗炎和心血管保護作用[3,10]。有研究發現，SFN可以抑制HMGB1的分泌，減弱炎癥因子的表達，減輕炎癥反應，減輕肺組織損傷，從而提高膿毒癥誘導小鼠的存活率[4]。然而SFN能否緩解膿毒癥引起的心肌損傷尚未見報道。本課題組前期研究發現，SFN可通過Sirt l信號通路減弱心肌凋亡及內質網應激，保護心肌缺氧復氧損傷[5]。因此，我們提出假設，SFN可以通過抑制氧化應激和凋亡保護膿毒癥心肌損傷。在本實驗中，我們發現盲腸結扎造模后小鼠心肌損傷標志物CK和LDH明顯升高，左室腔擴張，左室射血分數明顯下降，心臟收縮功能受損，而應用SFN治療后，心肌損傷減輕，心功能較模型組明顯改善，表明SFN具有減輕心肌損傷和改善心功能的作用。

越來越多的證據表明，氧化應激反應是膿毒癥發病的基礎，它可以損害血管通透性，惡化心臟功能，同時還能使線粒體功能發生障礙而導致呼吸功能受損，導致膿毒癥死亡率增加[11]。線粒體功能障礙可導致ROS生成增加，過量ROS可以進一步導致過氧化反應，其產物MDA能加重心肌損害。ROS含量和MDA水平不僅能反映氧化應激損傷的程度，也是間接評估細胞損傷的指標[12]。在本實驗中，CLP組小鼠造模成功后，心肌組織ROS含量和MDA水平明顯升高，表明膿毒癥影響到線粒體功能障礙，發生氧化應激反應，而進一步損傷心肌和心臟功能；應用SFN處理后,ROS和MDA明顯下降，表明氧化應激收到抑制。SOD能夠清除氧自由基，通過一系列的生物和化學反應，將過氧化物最后代謝為氧和水，也被作為評估心肌氧化應激和損傷程度的一個指標；GSH-Px也是一種重要的機體抗過氧化物酶，在保護生物體免受氧化應激損傷過程中起重要作用，這類酶能通過復雜的生物化學反應，最終將脂質過氧化物還原成為相應的醇或水[13]。本實驗中，CLP組小鼠造模后SOD和GSH-Px明顯下降，表明膿毒癥小鼠的抗氧化應激酶受到消耗。而應用SFN處理后，SOD和GSH-Px均明顯升高，表明氧化應激反應受到抑制。本部分實驗結果提示，SFN可以抑制膿毒癥心肌組織氧化應激而改善心肌損傷和心臟功能。

細胞凋亡參與膿毒癥的發病過程，它可以通過外部或內在刺激被觸發。ROS的過量產生能夠使脂類發生過氧化反應，破壞細胞膜的完整性，形成凋亡小體，通過DNA裂解和染色質凝集與caspase反應，啟動凋亡通路，加重膿毒血癥心肌損傷[11,14]。有學者研究發現，內質皮素通過抑制內質網應激導致的凋亡而保護膿毒癥導致的心肌損傷[15]。本實驗中，CLP組小鼠盲腸結扎穿孔造模之后，凋亡指數增加，促凋亡蛋白Bax及Caspase-3表達水平也明顯增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平表現為明顯下降(P<0.05)，表明膿毒癥小鼠心肌組織發生凋亡。而應用SFN處理后，上述凋亡指標發生了反轉(P<0.05)，表明SFN可以減弱膿毒血癥導致的心肌凋亡。這些結果提示，SFN對膿毒癥心肌損傷的保護作用，也可歸因于其抗凋亡作用。

綜上所述，我們的研究數據首次證實蘿卜硫素可有效保護膿毒癥導致的心肌損傷，其機制可能與抑制線粒體氧化應激反應及抗凋亡有關。因此，蘿卜硫素應該被視為預防膿毒癥心肌損傷潛在治療藥物。

(致謝：本課題在鄭州大學第一附屬醫院重點實驗室完成，特別感謝實驗的指導老師及各位參與者！)