黃顙魚擬態弧菌的鑒定、毒力相關因子及藥敏特性

藺凌云 馮東岳 潘曉藝* 姚嘉赟 尹文林 曹 錚 劉憶瀚 夏焱春 沈錦玉*

(1.浙江省淡水水產研究所浙江省魚類健康與營養重點實驗室,湖州 313001;2.全國水產技術推廣總站,北京 100125)

潰瘍病是一種常見的魚類疾病,其顯著特征是魚體頭部、中部或背部出現嚴重的開放性皮膚潰瘍。已報道的可引起魚類潰瘍病的病原種類繁多,包括鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、創傷弧菌(V. vulnificus)、非典型殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)、維氏氣單胞菌溫和亞種(A. veronii biovar sobria)、海洋屈撓桿菌(Flexibacter maritimus)等[1,2],此外彈狀病毒(Rhabdoviruses)、雙RNA病毒(Birnaviruses)及絲囊霉菌(Aphanomyces invadans)等亦有報道[3,4]。雖然這些病原均可導致魚體的潰瘍癥狀,但潰瘍的發病率、形成部位、特征及流行特點等存在較大差異。黃顙魚(Yellow catfish,Pelteobagrus fulvidraco)是我國長江中下游地區一種重要的經濟養殖品種。2011年,黃顙魚潰瘍病首先暴發于廣東和廣西兩省,隨后在四川、湖北、浙江、湖南、江西等多地發生或流行,發病魚的死亡率為70%—100%。已報道的黃顙魚潰瘍病病原有擬態弧菌(V. miminus)、溫和氣單胞菌(A. sobria)和維氏氣單胞菌(A. veronii)[5—7]。2018年,黃顙魚潰瘍病在浙江省大面積暴發流行,發病時間自5月至10月,造成了巨大經濟損失,目前該病已成為黃顙魚養殖的最大威脅。病魚體表呈現規則形潰瘍,與Zhang等[5]報道的擬態弧菌感染黃顙魚引發的潰瘍癥狀極為相似。鑒于黃顙魚潰瘍病病原的多樣性,為驗證本區域黃顙魚潰瘍病的病原是否為擬態弧菌,并分析該病的病原特點,本文對浙江省黃顙魚主養區的多個典型發病養殖場進行潰瘍病病原菌的分離鑒定,并對病菌的致病性、毒力因子、毒力相關基因及藥物敏感性等進行了研究。旨為黃顙魚潰瘍病的防治及擬態弧菌致病因子或致病機理的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

患病黃顙魚采自浙江省湖州市多家發病典型的黃顙魚養殖場,采樣時間2018年5—9月,病魚體表呈現規則形潰瘍,病變部位通常為方形,方形邊緣有紅色的出血帶(圖1)。革蘭氏陰性細菌鑒定板購自BD公司。BHI培養基、TCBS培養基、DNA營養瓊脂、明膠培養基、卵磷脂瓊脂基礎、50%卵黃液購自青島海博生物技術有限公司。脫脂奶、脫纖維兔血、血瓊脂基礎等購自北京索萊寶科技有限公司。細菌微量生化反應管購自杭州濱河微生物試劑有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒、PCR相關試劑等購自寶生物(大連)有限公司。磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑等14種原料藥購自國邦醫藥化工集團有限公司。用于攻毒試驗的雜交黃顙魚(黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚♂),購自德清某水產養殖場,體重80—100 g。枯草芽孢桿菌B115為本實驗室分離并保存菌株[8]。

圖1 發病黃顙魚的臨床癥狀Fig.1 The clinical signs of diseased yellow catfish

1.2 菌株的分離與純化

患病黃顙魚體表用酒精棉消毒,在無菌條件下,分別取肝、脾、腎和潰瘍病變等處的組織于BHI平板進行劃線分離。平板放置28℃培養箱1—2d后,挑取優勢單菌落進行純化培養,在多次純化后,對獲得的菌株進行保藏。各菌株的來源地、采樣時間等信息詳見表1。

表 1 患病黃顙魚中分離菌株的信息Tab.1 The information of the pathogens isolated from diseased yellow catfish

1.3 菌株的鑒定

菌株生理生化鑒定及培養特性觀察將分離純化的菌株進行革蘭氏染色,分別應用BD PhoenixTM100全自動微生物鑒定分析系統和細菌微量生化反應管進行鑒定。菌株分別在BHI及TCBS培養基上劃線培養,觀察菌落形態及生長情況。

分子鑒定過夜培養(16—18h)的新鮮菌液,使用細菌基因組DNA提取試劑盒抽提DNA。采用PCR方法分別擴增16S rRNA和pyrH基因,引物序列及目的片段大小等見表2。16S rRNA及pyrH的PCR反應體系: 2×premixTaq25 μL,上下游引物(濃度為10 μmol/L)各2 μL,DNA模板1 μL(20—100 ng),ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序: 94℃ 5min;94℃變性30s,退火溫度見表2,30s,72℃延伸(16S rRNA 100s,pyrH60s);35個循環后72℃溫育10min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增目的條帶。PCR 產物純化后交由杭州尚亞生物公司進行測序。分別將測序獲得的16S rRNA和pyrH基因序列與GenBank中已知核酸序列進行同源比對,使用MEGA X軟件對從GenBank 數據庫中獲得的序列相似性較高的菌株序列進行多序列比對,采用最大似然法(Maximum Likelihood method)的Jukes-Cantor 模型構建系統發育進化樹,并通過Boot-strap法(1000次重復)檢驗。

1.4 人工感染試驗

健康雜交黃顙魚在循環水養殖系統暫養1周,隨機分為9組,每組20尾。選取生理生化特性差異明顯的2株代表菌Hsy0531-K和Hsy0820-Sk以腹腔注射方式進行人工感染試驗。攻毒菌株接種于BHI培養基,28℃恒溫振蕩(180 r/min)培養24h,平板計數法測定菌液濃度。無菌PBS制備成1.25×108、1.25×107、1.25×106和1.25×105CFU/mL的菌懸液。腹腔注射攻毒組,每尾注射0.2 mL菌液,空白對照組腹腔注射0.2 mL PBS。每天記錄發病及死亡情況,連續觀察14d,根據Reed-Muench方法[11]計算攻毒菌株的LD50。對感染發病黃顙魚進行細菌分離培養鑒定。

表 2 本研究所用引物Tab.2 Primers used in this study

1.5 菌株毒力相關因子的檢測

溶血活性及胞外酶活性檢測將菌株接種血瓊脂(含5%脫纖維兔血)平板中,28℃培養24h,出現溶血圈則判斷其具有溶血活性。分離菌的胞外蛋白酶(5%脫脂乳的營養瓊脂)、卵磷脂酶(5%卵黃瓊脂)及DNA酶活性(0.2% DNA營養瓊脂)采用平板檢測法;明膠酶活性采用試管液化法檢測。將菌株點種于培養基平板中,28℃恒溫培養24—72h,以生理鹽水為陰性對照。蛋白酶: 以菌落周圍出現明顯的透明水解圈為陽性。卵磷脂酶: 在菌落周圍形成乳白色混濁環,即為陽性。DNA酶: 用1 mol/L鹽酸覆蓋平板,5min后觀察結果,在菌落周圍出現透明環為陽性。明膠酶: 菌株穿刺接種明膠培養基試管,于28℃恒溫培養48h后,置于4℃冰箱30min后觀察,如仍為液態,即為陽性。

鐵載體鐵載體檢測采用通用CAS瓊脂平板法[12]。CAS檢測培養基及MKB無鐵培養基的配置參考文獻[12,13],試驗中用到的器皿需進行脫鐵處理。分離菌株接種液體MKB無鐵培養基,28℃,180 r/mim振蕩培養3d,進行鐵饑餓處理。菌液離心并用無菌生理鹽水洗2次,取10 μL菌懸液接種于CAS檢測平板,28℃培養2d,觀察平板的顏色變化。以菌落周圍產生鐵載體螯合暈圈為陽性。陰性對照組為按同樣方法處理的枯草芽孢桿菌B115。

毒力相關基因檢測PCR擴增毒力相關基因:ctxA(cholera toxin enzymatic subunit A,霍亂毒素酶亞基A)、zot(zonula occludens toxin,帶毒素)、ace(accessory cholera enterotoxin,副霍亂毒素)、tcpA(toxin-coregulated pilus,毒素共調菌毛)、ompU(outer membrane protein U,外膜蛋白U)、toxR(central regulatory protein,中央調控蛋白)、vmh(V.mimicushemolysin,擬態弧菌不耐熱溶血素)、st(heat-stable enterotoxin,耐熱腸毒素)、tdh(thermostable direct hemolysin,耐熱直接溶血素),matCDBiucABCD-iutA(aerobactin transport and biosynthesis genes,鐵載體運輸及合成基因簇)。其引物序列見表2。PCR反應體系和擴增程序同上文分子鑒定,各基因的退火溫度及延伸時間參見表2。PCR產物采用1.0%—1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并對目的條帶進行測序分析。

1.6 藥物敏感性試驗

測試抗菌藥物包括7大類14種,磺胺類4種[磺胺嘧啶(SD)、磺胺甲噁唑(SMZ)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)],喹諾酮類2種[環丙沙星(CIP)、恩諾沙星(ENR)],四環素類2種[強力霉素(DC)、土霉素(OXY)],β內酰胺類1種[氨芐西林(AMP)],大環內酯類2種[紅霉素(E)、交沙霉素(JOS)],氯霉素類2種[甲砜霉素(THA)、氟苯尼考(FFC)],氨基糖胺類1種[新霉素(NEO)]。采用微量二倍稀釋法測定上述藥物對11株擬態弧菌的最小抑菌濃度(MIC)。各藥物的溶解、稀釋、質控范圍參照CLSI動物源細菌抗菌藥物敏感性試驗紙片法與稀釋法執行標準[18],并依據該標準推薦的MIC折點報告敏感、中介和耐藥,對部分缺乏判定標準的藥物其濃度折點值參考人源的解釋標準[19]。多重耐藥(Multiple antibiotic resistance,MAR)系數以菌株耐受抗菌藥物總數與受試抗菌藥物總數的比值表示[20]。使用SPSS 16.0軟件計算分離菌株對14種抗菌藥物的半數最低抑菌濃度(MIC50)。

表 3 分離菌株的生理生化特性Tab.3 Biochemical and physiological characteristics of theisolated strains from diseased yellow catfish

2 結果

2.1 菌株的表型特征及生理生化鑒定

從患病黃顙魚體表潰瘍病變部位及內臟組織中均分離到了大量菌落特征一致的優勢菌。優勢菌株在BHI平板上,形成表面光滑、濕潤、微隆起、邊緣整齊的淺黃色圓形菌落;在TCBS平板上形成表面光滑,邊緣整齊的綠色圓形菌落。革蘭氏染色為陰性,BD PhoenixTM100全自動微生物鑒定分析系統的生化報告結果見表3: 各菌株的生化特征基本相似,部分生化指標存在差異性,如底物甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、L-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素、賴氨酸-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素等的生化反應,這些差異指標為生化鑒定的常規項目,其與菌株毒力的相關性未見報道,儀器鑒定結果顯示各菌株與擬態弧菌及霍亂弧菌的相似度最高,可信度值均在90%以上。采用細菌微量生化鑒定管進一步區分,各分離菌株V-P試驗、脂酶(玉米油)、酒石酸鹽等生化反應均為陰性,這些結果與擬態弧菌的理化特性一致。

續表 3

2.2 16S rRNA和pyrH基因序列同源性分析

將分離菌株16S rRNA 基因序列通過NCBI的Blastn檢索系統進行序列比對,結果顯示11株分離菌與V. miminus及V. cholerae的同源性最高。在基于分離菌及其他弧菌屬菌株16S rRNA序列構建的系統發育樹上(圖2),各菌株與V. miminus聚為一支,同時與V. cholerae的同源關系也非常接近。在以pyrH基因序列構建的系統發育樹上(圖3),各菌株與V. miminus聚為一支,而各V. cholerae則聚為另外一支。綜合分離菌株的表型特征、理化特性及16S rRNA和pyrH基因序列同源性分析,判定11株分離菌均為擬態弧菌。

圖2 分離菌16S rRNA 基因序列系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of isolated strains from diseased yellow catfish based on the sequences of the 16S rRNA genes

2.3 菌株對黃顙魚的致病性

使用菌株Hsy0531-K和Hsy0820-Sk腹腔注射感染健康黃顙魚,攻毒后1d,高濃度組開始死亡,但體表的潰瘍癥狀尚未顯現,攻毒后第2天,黃顙魚體表出現褪色斑,3—7d 表現出明顯的潰瘍癥狀,為發病及死亡的高峰期,各濃度組的累計死亡情況見表4,對照組在實驗觀察期內未出現典型的潰瘍癥狀及死亡現象。其中,菌株Hsy0531-K的LD50為6.28×105CFU/尾,菌株Hsy0820-Sk的LD50為1.05×106CFU/尾。取感染發病的黃顙魚進行細菌分離,再分離的細菌經菌落形態、生化特征及16S rRNA、pyrH基因序列分析,確定為擬態弧菌。

2.4 毒力相關因子

溶血活性及胞外酶活性11株擬態弧菌在5%脫纖維兔血平板上培養24h后,菌落周圍均出現了溶血圈,呈β溶血(圖4a);在5%脫脂奶的營養瓊脂平板上培養24h后,菌落周圍均出現清晰透明的水解圈(圖4b);在DNA營養瓊脂平板上培養24h后,1 mol/L鹽酸覆蓋平板5min,菌落周圍均出現明顯的透明環(圖4c);在明膠培養基試管中培養48h,4℃冰箱放置30min后取出,培養基仍為液體狀態(圖4d);在5%卵黃瓊脂平板上培養72h,菌落周圍未出現渾濁帶。上述試驗結果表明: 分離菌株具有溶血活性、酪蛋白酶、明膠酶和DNase活性,但不具有卵磷脂酶活性。

鐵載體檢測11株擬態弧菌及枯草芽孢桿菌B115在CAS檢測平板上培養2d后,試驗菌株周圍均出現明顯的鐵載體暈圈(圖4e),而接種枯草芽孢桿菌的陰性對照,菌落周圍沒有產生鐵載體暈圈(圖4e)。

毒力相關基因的PCR擴增通過PCR擴增,11株擬態弧菌均擴增到了外膜蛋白U基因ompU、中央調控蛋白基因toxR和不耐熱溶血素基因vmh及鐵載體運輸及合成基因簇matCDB-iucABCD-iutA的目的片段,片段大小分別為869、779、390、3300、3300及2900 bp。對擴增陽性的條帶進行測序和序列比對發現,各菌株ompU、toxR和vmh與Gen-Bank上登錄擬態弧菌(ATCC33653)的ompU、toxR和vmh基因序列的同源性分別為98.00%、99.12%、98.73%。而其他毒力相關基因tcpA、ctxA、st、zot、ace、tdh均未擴增到目的條帶。

圖3 分離菌pyrH基因序列系統發育進化樹Fig.3 Phylogenetic tree isolated strains from diseased yellow catfish based on the sequences of the pyrH genes

2.5 藥物敏感性

如表5所示,磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺間甲氧嘧啶的耐藥率最高,為100%,其MIC50＞512 mg/L。其次是氨芐青霉素,耐藥率達90.9%,MIC50為128 mg/L。菌株對喹諾酮類、四環素類、大環內酯類及氯霉素類等4類抗菌藥物的敏感性較強。其中,恩諾沙星、強力霉素、土霉素、氟苯尼考、環丙沙星、交沙霉素、紅霉素的敏感率為100%,甲砜霉素和新霉素的敏感率分別均為90.9%和81.8%。這8種高敏感抗生素(敏感率＞90%)的MIC50(表5),以恩諾沙星最低,其MIC50≤0.125 mg/L。其余依次為強力霉素、交沙霉素、紅霉素,MIC50均為0.25 mg/L,土霉素、環丙沙星、氟苯尼考,MIC50均為0.5 mg/L,甲砜霉素略高,其MIC50為2.0 mg/L。磺胺二甲氧嘧啶是4種磺胺類藥物中,唯一一種對擬態弧菌生長抑制有效的藥物,其敏感率90.9%,MIC50≤128 mg/L。表6為菌株的耐藥譜型及多重耐藥系數,11株擬態弧菌均表現為多重耐藥,多重耐藥系數0.29—0.45。優勢耐藥譜型為SD-SMZ-SMM-AMP,占81.8%。其余耐藥譜型SD-SMZ-SMM-AMP-NEO、SD-SMZ-SMM-THA-NEO,各占9.1%。

3 討論

3.1 黃顙魚潰瘍病病原的鑒定分析

全雄黃顙魚和雜交黃顙魚是浙江省養殖黃顙魚的主要品種,2018年黃顙魚潰瘍病暴發嚴重,流行病學調查發現,雜交黃顙魚的發病率高于全雄黃顙魚。目前,潰瘍病已成為危及黃顙魚健康養殖的主要病害,但對其病原的報道眾說紛紜。本研究從11個發病養殖場采集的樣本中,共分離到了50株細菌,經鑒定擬態弧菌42株,類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)4株,維氏氣單胞菌2株,溫和氣單胞菌2株(數據未發表)。綜合優勢菌的比例和回感試驗結果,可驗證擬態弧菌即為本區域黃顙魚潰瘍病的主要病原。同時,氣單胞菌和類志賀鄰單胞菌作為水產養殖中的常見條件致病菌[23—25],發病黃顙魚的混合感染常有發生。在研究過程中,發現擬態弧菌分離菌株用BD PhoenixTM100全自動微生物鑒定系統進行生化分析,鑒定結果同擬態弧菌及霍亂弧菌的相似性都很高,雖然擬態弧菌的可信度值稍高于霍亂弧菌,但兩者非常接近。這可能是該儀器配套的革蘭氏陰性菌鑒定板的檢測指標不能有效區分生化特性比較接近的物種。16S rRNA和pyrH基因的分子鑒定表明,基于16S rRNA基因的序列同源性檢索及系統發育樹分析,仍不能將檢索出的擬態弧菌和霍亂弧菌明顯區別開,有研究發現擬態弧菌和霍亂弧菌的16S rRNA基因的序列同源性接近100%[26];而基于pyrH基因的序列同源性檢索及系統發育樹分析,可以將擬態弧菌和霍亂弧菌區別開來。Thompson等[27]的研究表明,pyrH基因序列的種間相似性不超過91%,而種內相似性高于95%,對于區分這兩種相近弧菌的分辨力最強。Zago等[28]的研究也證實了這一觀點。

表 5 黃顙魚源擬態弧菌藥物敏感性及MIC50Tab.5 MIC50 results and antibiotics susceptibility of Vibrio mimicus isolates from diseased yellow catfish

表 6 黃顙魚源擬態弧菌的多重耐藥譜Tab.6 Multiple antibiotic resistance profile of Vibrio mimicus isolates from diseased yellow catfish

3.2 擬態弧菌的毒力相關因子及毒力基因流行分析

溶血素是擬態弧菌的重要毒力因子,它通過破壞紅細胞膜和提高腸上皮細胞內cAMP濃度而表現出溶血性和腸毒性[29]。擬態弧菌的溶血素有耐熱溶血素和不耐熱溶血素兩種,其中由vmh基因編碼的不耐熱溶血素(VMH)最為常見,Shinoda等[30]和Bi等[31]的檢測結果表明,vmh基因存在于所有擬態弧菌的臨床及環境分離株中。本研究的11株擬態弧菌均擴增到了vmh基因,血平板上亦表現出了明顯的溶血活性,但耐熱溶血素基因tdh并未檢測到。有研究發現[15,30],擬態弧菌耐熱溶血素(TDH)主要存在于臨床分離株中,而非環境分離株。鐵載體是細菌為克服宿主環境的鐵限制而產生的一種有機化合物,它能吸收和螯合微量鐵元素。鐵的攝取和利用對細菌的生長和毒性具有重要作用。擬態弧菌的鐵載體(Aerobactin)為異羥肟酸型,霍亂弧菌的主要鐵載體(Vibriobactin)為鄰苯二酚型,鐵載體的不同亦是鑒別兩種弧菌的標志特征[32]。Alam等[33]對77株擬態弧菌進行研究,其中84%菌株可以產生鐵載體。本研究中的11株擬態弧菌均檢測到了鐵載體表型(圖4e)和鐵載體(Aerobactin)運輸及合成相關基因簇(matCDB-iucABCD-iutA)。2018年浙江暴發的黃顙魚潰瘍病,在潰瘍病變的邊緣肌肉呈鮮紅色,似出血癥狀,但質地正常(未潰爛,圖1)。我們推測,這與擬態弧菌產生的溶血素有關。溶血素促使血液中的血紅蛋白增加,鐵載體奪取血紅蛋白中的鐵元素,兩種毒力因子協同增效,使得宿主體內的鐵被不斷消耗,菌株得以迅速大量增殖。

此外,各種胞外酶活性也是弧菌毒力的重要因素。胞外蛋白酶是一類廣泛存在的酶,在細菌致病性、應激反應和細胞活力等方面發揮著重要作用[34]。明膠酶是一種潛在的毒性因子,它缺乏明顯的底物特異性,可水解酪蛋白、血紅蛋白、膠原蛋白等多肽[35],造成廣泛的組織損傷,并有助于細菌在高密度環境中的傳播。DNase可降解胞外DNA,不僅為細菌的增殖提供重要的物質來源,也是病原通過組織傳播及免疫逃逸的重要手段。Beshiru等[36]對從即食蝦上分離的弧菌進行了胞外毒力特性的研究,發現在擬態弧菌中,蛋白酶、明膠酶、DNase的陽性率分別為90%、100%和100%。在本研究中11株擬態弧菌三種酶的陽性均為100%。存在較大分歧的是,在Beshiru等[36]的研究中,擬態弧菌的脂酶陽性率為100%,而本研究分別對脂酶(分別以玉米油、吐溫為底物)和卵磷脂酶(以卵黃液為底物)進行了檢測,結果均為陰性。Davis等[22]對不同來源及血清型的51株擬態弧菌的生理生化進行了系統研究,僅10%的擬態弧菌表現為脂酶(玉米油為底物)陽性。可見擬態弧菌在脂酶活性這一表型特征上存在較大的差異性。

外膜蛋白(Outer membrane proteins,Omps)是革蘭氏陰性菌外膜的主要結構,與維持細胞形態、物質代謝、組織黏附及致病等密切相關。王薇等[37]的研究證實了OmpU是擬態弧菌的一種重要黏附素,它通過黏附參與致病作用。toxR基因在弧菌科細菌中分布較廣,但在不同的弧菌中其調控機制不盡相同。在霍亂弧菌中,ToxR是毒力基因表達的主要調控蛋白[38],在創傷弧菌和副溶血弧菌中,ToxR分別參與調控vvh(Vibrio vulnificushemolysin gene) 和tdh的表達[39,40]。ctxA、zot及ace基因是霍亂毒素的核心遺傳元件。研究發現,霍亂弧菌流行株均為產霍亂毒素的菌株。毒素共調菌毛( TCP)是霍亂弧菌和擬態弧菌等常見的黏附素之一,具有組織細胞黏附性和血凝性,tcpA是其主要結構亞單位基因,與霍亂毒素(CTX)的表達協同進行。由st編碼的耐熱腸毒素(ST)通過改變細胞內外離子平衡,導致小腸內腸液大量聚集而致病。本試驗中11株擬態弧菌均擴增出了ompU和toxR基因,而ctxA、zot、ace、st、tcpA均未擴增到。韓帥等[41]對4株鲇源擬態弧菌的毒力基因進行檢測,結果顯示各菌株均攜帶ompU基因,而不具有ctxA、zot、ace、tcpA和toxR。Singh等[14]研究發現,所有擬態弧菌均攜帶toxR基因,ctxA、zot、ace基因的攜帶比例均為1/11,tcpA和ompU均為2/11。Shinoda等[30]檢測了100株不同來源擬態弧菌的毒力基因,其中95%菌株有toxR基因,17%菌株存在st基因,ctxA和tcpA的攜帶率均為2%。已有的研究表明,上述毒力基因在擬態弧菌中均有發現,但尚未發現某個或某些毒力基因可以作為其致病性的有效指標,不同來源菌株的毒力基因型復雜多變。

3.3 黃顙魚源擬態弧菌的耐藥性

MAR系數是由Krumperman[20]首次提出,主要是反映環境受抗生素的污染程度及評價其對人類健康的風險,通常認為,MAR系數＞0.2即表明產品受到較高程度的污染和對人類健康有較大的風險。本實驗結果顯示,11株黃顙魚源擬態弧菌均表現為多重耐藥,其MAR系數(0.29—0.45)均超過了0.2,說明這部分黃顙魚受到抗菌藥物污染的程度較嚴重,對人類健康具有潛在威脅。

本研究對此次黃顙魚流行性潰瘍病病原的分離鑒定及病原特性分析,將為我國黃顙魚潰瘍病的防控、正確合理用藥、疫苗研發以及流行病學等研究提供依據。未來仍需進一步開展擬態弧菌的致病因子、耐藥基因及抗原基因的研究,開發高效疫苗,通過免疫防控減少抗生素的使用,以保證我國黃顙魚養殖產業的健康可持續發展。此外,建立快速準確簡便的早期診斷方法也是有效控制擬態弧菌感染的重要手段。