縊蟶養殖池塘氨氧化微生物的季節變化特征

王鑫毅 趙 婧 金 珊 趙青松 周素明 竺俊全

(1.寧波大學海洋學院,寧波 315832;2.寧波大學高等技術研究院,寧波 315211)

近年來,隨著縊蟶(Sinonovacula constricta)養殖的不斷發展,高密度集約化的養殖方式使得縊蟶養殖過程中經常出現縊蟶生長速度慢,活力低下甚至頻發不明原因死亡的現象,而養殖水體環境的惡化是造成以上情況的主要原因[1],其中氨氮污染是水產養殖中的最直接、最重要的脅迫因子[2]。養殖環境中過高的氨氮會造成水生動物的毒害作用,導致免疫力下降,增加感染疾病的風險[2,3]。據報道,養殖環境中的氮素主要來源于飼料及養殖生物的排泄物,Hargreaves等[4]的研究表明,大約只有30%左右的飼料氮素被養殖生物利用,而70%左右的飼料氮素被排放到養殖環境中;Jackson等[5]對蝦類養殖過程進行了監測,結果顯示投入的飼料氮只有22%轉化為蝦生物量,而14%沉積在底泥,54%被排放到水環境中;高攀等[6]對草魚的養殖研究也認為只有占總氮35.4%—37.9%的氮素是以魚體的形式產出。因此,如何解決氮素污染是目前水產養殖綠色發展面臨的關鍵問題。

自然界對氮素污染物的自凈能力主要取決于氮素轉化微生物的作用,而硝化作用是自然界氮素循環的核心環節,也是氨氮脫除過程中至為重要的一步,其包括氨氧化作用以及亞硝化作用[7]。氨氧化作用是硝化作用的第一步,也被認為是硝化作用的限速步驟,主要由氨氧化細菌(Ammonia-oxidizing bacterial,AOB)和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea,AOA)進行驅動[8]。已有的研究表明,AOA和AOB的氨氧化作用主要是由其體內的氨單加氧酶(Ammonia monooxygenase,AMO)催化的,而amoA基因編碼了AMO其中一個亞基[9],由于amoA基因具有較強的保守性,且已被證實在AOA和AOB中均含有amoA基因[10,11],因此,現今amoA基因已成為AOA和AOB的主要分子標記之一[7]。目前,對于AOA和AOB的研究主要集中于湖泊沉積物[12—14]、土壤[15,16]等環境中,而關于水產養殖環境的相關報道較少,主要有南美白對蝦(Penaeus vanname)[17]、草魚(Ctenopharyngodon idellus)[18]及太湖中魚蝦蟹混養區[19]等水產動物養殖環境中AOA和AOB的相關分析,且已有的研究基本也是針對淡水養殖環境的。因此,為了進一步明確海水養殖環境中氨氧化微生物的動態變化及與養殖動物的相關性,本研究利用熒光定量PCR技術對縊蟶養殖池塘水體和沉積物中AOA和AOB的amoA基因進行了定量分析,探討縊蟶養殖過程中氨氧化微生物的季節動態變化及環境因子相關性,以期為養殖過程中氮素循環的有效管理及水質調控技術的研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

試驗用水樣、泥樣及縊蟶均來自寧波市寧?？h長街鎮合成村(29.21N,121.7E)養殖狀況良好的縊蟶養殖塘(153 m×62 m),塘深約1 m,養殖塘于2018年4月4日放養來自三門縣的甬樂一號苗200 kg,8000粒/kg。試驗于2018年4月(春季)、7月(夏季)、10月(秋季)、2019年1月(冬季)利用5點采樣法采集樣品,每個點使用2.5 L有機玻璃采水器采取養殖水體中上層距離水面約40 cm處水樣[20],再將5個點的水樣均勻混合作為每個月的試驗用水樣;泥樣也分為相同的5個點,將每個點取得的泥樣均勻混合后作為每個月試驗用泥樣,每種樣本按相同的方法采三次作為試驗平行,將所采樣品于4℃保存,所有樣品的DNA提取在24h內完成。

1.2 養殖池塘水質指標測定

溫度、溶解氧、pH采用YSI 556水質檢測儀測定,透明度利用透明度盤測定,鹽度利用鹽度計測定,其余水質因子依據海洋監測規范(GB17378.4—2007)進行測定,過硫酸鉀氧化法測定總氮(TN)和總磷(TP),次溴酸鈉氧化法測定氨氮(NH),鋅鎘還原法測定硝態氮(NO),鹽酸萘乙二胺測定亞硝酸鹽氮(NO),磷鉬藍法測定活性磷(PO),高錳酸鉀氧化法測定化學需氧量(COD)。

1.3 樣品DNA提取

水樣每組平行100 mL水用0.22 μm的無菌纖維素濾膜過濾,過濾后的濾膜剪碎,用于DNA提取;沉積物樣每個平行取500 mg。各樣品都利用Fast DNA Spin Kit for Soil試劑盒(MPbio,USA)按照試劑盒說明書提取總DNA,經Nano Drop 2000蛋白質核酸分析儀(ThermoFisher,USA)測定提取出的DNA濃度和純度后,將DNA樣品于-20℃中保存,用于后續分析。

1.4 絕對定量標準曲線的制作

將提取的水樣及沉積物樣的DNA作為PCR擴增模板,AOBamoA基因擴增引物為bamoA1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)和bamoA2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)[21],AOAamoA基因擴增引物為amoAF(5′-STAATGGTCTG GCTTAGACG-3′)和R(5′-GCGGCCATCCATCT GTATGT-3′)[21],擴增體系為2×TaqMasterMix(康為世紀)25 μL,正反向引物濃度為10 μmol/L各2 μL,DNA模板2 μL,加ddH2O補足至50 μL。PCR擴增程序如下: AOB: 94℃,2min;(94℃,30s;55℃,30s;72℃,30s)×35;72℃,2min;AOA: 94℃,2min;(94℃,30s;53℃,30s;72℃,30s)×35;72℃,2min。使用Gel Extraction Kit (OMEGA) 切膠回收試劑盒對PCR產物進行回收,回收產物與pMD18-T載體連接后轉入DH5α 感受態細胞中,進行藍白斑篩選。選取白色克隆后利用菌落PCR進行陽性克隆鑒定,載體引物為M13F和M13R,將挑取出的白色克隆進行測序,與NCBI比對,AOB與亞硝化單胞菌(KU365739.1)amoA基因同源性99%,AOA與泉古菌(JQ345856.1)amoA基因同源性99%,因此可作為絕對定量標準品。利用Plasmid Mini Kit (OMEGA)提取重組質粒,經Nano Drop 2000蛋白質核酸分析儀測定DNA濃度,AOB重組質粒DNA濃度為80.09 ng/μL,AOA重組質粒DNA濃度為452.02 ng/μL。根據阿伏伽德羅常數計算amoA基因拷貝數,AOB為2.30×1010copies/μL,AOA為1.24×1011copies/μL,將AOA及AOB重組質粒DNA以10倍濃度稀釋6個梯度,用于標準曲線的繪制。

1.5 amoA基因熒光定量PCR

采用Roche LighterCycler?480 Ⅱ熒光定量PCR擴增儀進行定量,擴增體系為: 2×Trans Start Tip Green qPCRSuper Mix(全式金) 10 μL,濃度為10 μmol/L的AOA、AOB正反向引物各0.4 μL,DNA模板1 μL,用dd H2O補足至20 μL。反應程序如下: AOB:94℃,30s;(94℃,5s;55℃,15s;72℃,10s)×40;AOA: 94℃,30s;(94℃,5s;53℃,15s;72℃,10s)×40。每個樣品設置三個平行。

1.6 數據處理

利用SPSS 20.0進行數據分析,利用單因素方差分析(One way ANOVA)比較水質因子、AOB和AOA豐度的季節變化的顯著性,利用Pearson相關系數法分析豐度與水環境因子的相關性,利用多元線性回歸方程做環境因子與氨氧化微生物豐度的回歸分析。

2 結果

2.1 不同季節縊蟶養殖池塘水質指標

如表1所示,季節變化對于池塘水質理化因子有一定的影響,四季的水溫、硝氮、亞硝氮及透明度均呈顯著差異(P＜0.05);冬季溶氧和總氮含量顯著高于其他季(P＜0.05),而春夏季無顯著差異(P＞0.05);春季總磷最低,且顯著低于夏秋季(P＜0.05),與冬季無顯著差異(P＞0.05);活性磷在春季顯著高于其余三季(P＜0.05),夏秋季無顯著差異(P＞0.05);氨氮濃度在秋季最高,顯著高于冬夏兩季(P＜0.05);夏季化學需氧量顯著高于其余三季(P＜0.05)。

2.2 不同季節AOB和AOA的 amoA基因豐度變化

如圖1所示,在水體中,四個季節AOB的amoA基因拷貝數變化范圍在(1.82—5.13)×104copies/mL,其中秋季最高且顯著高于其余三季(P＜0.05),其余三季之間無明顯差異(P＞0.05);AOA的amoA基因拷貝數變化范圍為(5.65—6.73)×105copies/mL,冬季為最低值且與春秋兩季有顯著差異(P＜0.05)。在沉積物中,四個季節的AOB的amoA基因拷貝數變化范圍在(1.45—8.35)×107copies/g,最高值在冬季且顯著高于其余三季(P＜0.05),春夏秋季含量無明顯差異(P＞0.05);AOA的amoA基因拷貝數變化范圍在(2.546.04)×108copies/g,最高值在冬季且顯著高于其余三季(P＜0.05),春夏秋季含量無明顯差異(P＞0.05)。

表 1 不同季節縊蟶養殖池塘水質指標Tab.1 Water quality index of Sinonovacula sinensis pond in different seasons

從圖2中可以看出在縊蟶養殖池塘水體及沉積物中的AOA的數量均比AOB的數量高一個數量級,在夏季水體中比值達到最高,且與秋冬季呈顯著差異(P＜0.05),而在沉積物中秋季比值達到最高,與冬季呈顯著差異(P＜0.05)。

2.3 水體及沉積物中AOB和AOA豐度與水環境因子的相關性

如表2所示,在水中,AOB豐度與酸堿度(r=?0.722,P=0.008)、氨氮(r=0.698,P=0.012)呈顯著正相關,與亞硝氮(r= -0.589,P=0.044)、透明度(r=0.728,P=0.007)呈顯著負相關,與水溫、溶解氧、總磷、活性磷、總氮、硝氮和化學需氧量相關性不顯著(P＞0.05);AOA豐度與水溫(r=0.631,P=0.028)呈正顯著相關,與硝氮(r=-0.720,P=0.008)呈負顯著相關,與溶解氧、酸堿度、總磷、活性磷、總氮、氨氮、亞硝氮、化學需氧量及透明度呈不顯著相關(P＞0.05)。在沉積物中,AOB豐度與溶解氧(r=0.742,P=0.006)、硝氮(r=0.938,P=0.000)、總氮(r=0.655,P=0.021)及亞硝氮(r=0.577,P=0.050)呈顯著正相關,與水溫(r=-0.885,P=0.000)呈顯著負相關,與酸堿度、總磷、活性磷、氨氮、化學需氧量及透明度呈不顯著相關(P＞0.0 5);A O A 豐度與溶解氧(r=0.7 2 9,P=0.007)、總氮(r=0.676,P=0.016)、硝氮(r=0.895,P=0.000)呈顯著性正相關,與水溫(r= -0.863,P=0.000)、活性磷(r= -0.587,P=0.045)呈負顯著相關,與酸堿度、總磷、氨氮、亞硝氮、化學需氧量及透明度呈不顯著相關(P＞0.05)。

通過將水體中AOA和AOB、沉積物中AOA和AOB的豐度作為因變量,水環境因子作為自變量進行多元逐步回歸分析。由表3可知,硝氮、透明度、化學需氧量和總磷有入選回歸方程,其中水體中AOA豐度的回歸方程水質因子中有硝氮入選;水體中AOB豐度的回歸方程中有透明度和化學需氧量兩個水質因子入選;沉積物中AOA豐度的回歸方程有硝氮及總磷兩個水質因子入選;沉積物中AOB豐度的回歸方程只有硝氮入選。其中硝氮入選了3個方程,說明硝氮與縊蟶養殖池塘中氨氧化微生物豐度密切相關。

3 討論

3.1 縊蟶養殖池塘AOA和AOB的豐度

已有的研究表明,氨氧化微生物廣泛分布于淡水和海水水域及自然界的土壤系統中,由于這兩類細菌的生理生化等特性的差別,從而使得它們在不同的環境中存在著不同的生態位分化[22]。本文利用實時熒光定量PCR技術對不同季節縊蟶養殖池塘水體及沉積物中的AOA和AOB的豐度進行了研究,結果發現在不同季節縊蟶養殖池塘環境中AOA豐度均比AOB豐度高一個數量級,在數量上占據絕對優勢,這與高利海等對南美白對蝦養殖塘底泥[23]和Wuchter等[24]和Mincer等[25]對海洋環境的研究結果一致,而與Wu等[26]對太湖湖灣養魚區及Lu等[27]對湖北崇湖漁場的研究結果不同。作者認為這可能是AOA和AOB對海淡水環境的適應性不同所導致,由于AOA擁有比AOB更寬的生態位[28],使得AOA更能適應貧營養、厭氧、高鹽度等復雜的生態環境,因此,在縊蟶養殖池塘環境的氨氧化作用中AOA起著主導地位,而鹽度也是影響養殖池塘氨氧化微生物菌群結構的一個重要的因素,隨著養殖環境鹽度的上升,AOA的相對豐度會升高[29]。

圖1 水體和沉積物中AOB和AOA豐度的季節變化Fig.1 Seasonal abundance of the AOB and AOA in water and sediments

圖2 不同季節水體和沉積物中AOA與AOB的豐度比值變化Fig.2 Abundance ratio of AOA and AOB in water and sediments in different seasons

3.2 縊蟶養殖池塘AOA和AOB的季節動態變化與水環境因子的相關性

本研究結果表明,縊蟶養殖池塘水體及沉積物中的AOA和AOB豐度呈現一定的季節性波動,水中的AOB及AOA豐度均在秋季最高,且AOB顯著高于其余三季(P＜0.05),沉積物中的AOB及AOA均在冬季顯著高于其余三季(P＜0.05),而其余季節間無明顯差異。環境因子相關性分析顯示,水溫是影響縊蟶養殖池塘氨氧化微生物豐度的重要因素之一,水體中AOB與水溫呈負相關但不顯著(P＞0.05),AOA與水溫呈正顯著相關(P＜0.05),而沉積物中AOA和AOB與水溫呈顯著負相關(P＜0.05),這與潘彥宇等[12]、覃雅等[18]的研究結果相似。作者認為由于目前已知的AOB大多是屬于中溫類菌群,適合在40℃以下生長,最適生長溫度為20—30℃,而AOA對溫度的響應范圍要比AOB更廣,其對高溫環境和低溫環境的適應性高于AOB[30,31]。

此外,隨著養殖進程的推進,由于投餌、施肥及縊蟶等生物的糞便產生,使得養殖底泥中含氮物質不斷積累,而AOB和AOA是自然界氨氮物質硝化作用的推動者,因此沉積物中總氮、硝氮及亞硝氮均在冬季達到最高且顯著高于其余三季(P＜0.05),而本研究的結果表明,氨氮、亞硝氮及硝氮的濃度也在一定程度上影響著縊蟶養殖池塘氨氧化微生物的豐度。已有的研究表明,在一定范圍內氨氮含量的增加會促進氨氧化反應和氨氧化微生物的生長,但高水平的氨會抑制AOA的生長[32,33],Yasuda等[34]的研究發現AOA豐度與某些特異性游離氨濃度成正比,Limpiyakorn等[35]的實驗顯示AOA的氨氮半飽和濃度范圍在0.001—0.01 mg/L,而AOB的半飽和濃度則比AOA高1—4個數量級。而本研究檢測四季水體中氨氮濃度均小于1 mg/L,因此這可能也是縊蟶養殖池塘中AOA占主導地位的原因之一。

縊蟶養殖過程中養殖池塘與外界水體交換相對較少,當養殖密度過高或投餌量過大的時候,水體溶解氧會被大量消耗。而氨氧化過程是以氧氣作為反應基質,因此氧氣的濃度從某種意義上決定了AOA和AOB種類的分布[36]。在本研究中,沉積物中的AOA和AOB豐度均與溶解氧成顯著正相關(P＜0.05),且AOA在低氧濃度下更具生長優勢,這與印度池塘養殖沉積物[37]、美國湖泊沉積物[38]、黃東海泥質區[39]中的研究結果相類似,當溶解氧降低的時候養殖環境中的氨氧化過程會受到影響。另外,多元回歸方程和相關性結果也顯示,總磷、化學需氧量等其他環境因子對AOA和AOB的豐度也有一定的影響。

綜上所述,縊蟶養殖池塘中AOA及AOB的生長受到鹽度、溫度、氨氮濃度及溶解氧等多種環境因子的共同影響,由于AOA和AOB在自然界氮循環中有著重要的作用,尤其是AOA可能占據著縊蟶養殖塘氨氧化進程的主導地位。因此,在縊蟶養殖過程中需要加強水質指標的監控,尤其是含氮營養鹽指標,控制好養殖密度、投餌量及廢棄物的排放,適當投喂微生物等環境改良劑,防止水體富營養化,確保養殖過程中氮循環的穩定性,注重水產養殖與環境的可持續發展,提高縊蟶養殖產量。

表 2 水體及沉積物中AOB和AOA豐度與水環境因子的Pearson相關系數Tab.2 Pearson correlation coefficient of AOB and AOA abundance with water environmental parameters in water and sediments

表 3 縊蟶養殖池塘氨氧化微生物豐度與水環境因子的多元逐步回歸方程Tab.3 Stepwise multiple regression equation of ammoniaoxidized microbial abundance and water environment factors in Sinonovacula constricta pond