CrkⅡ表達水平對喉癌細胞Hep-2增殖、遷移及侵襲的影響

劉東東，周李芳，楊華暉

荊州市中醫醫院耳鼻咽喉頭頸外科，湖北 荊州 448002

喉癌是臨床常見的頭頸部惡性腫瘤，其中，絕大多數為喉鱗狀細胞癌，主要表現為呼吸困難、發音困難、聲音嘶啞等臨床癥狀，其具體發病機制目前尚未完全明確，可能與飲酒、吸煙、咽喉反流、胃食管反流、微量元素缺乏和放射線等因素有關，且通常多種因素相互作用[1-2]。根據發生位置的不同，喉癌可分為聲門上型、聲門型和聲門下型，具有局部腫瘤浸潤、區域淋巴結轉移、遠處擴散等特征。接頭蛋白CrkⅡ為原癌基因Crk表達的產物，在蛋白質之間起介導作用，介導細胞之間的信號轉導[3-4]。CrkⅡ與細胞骨架重構、侵襲、增殖、遷移及凋亡等均有一定關系[5]。本研究分析CrkⅡ表達對喉癌細胞Hep-2增殖、遷移及侵襲的影響，為喉癌患者的臨床診療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年12月至2018年12月荊州市中醫醫院收治的喉癌患者，所有患者均經病理檢查確診為喉鱗狀細胞癌，年齡為38～74歲，平均（56.27±5.09）歲。本研究共納入108例喉癌患者，收集其喉癌組織及癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣＞0.5 cm）的石蠟存檔標本。喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2由本院頭頸腫瘤課題組提供。

1.2 主要試劑與儀器

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640均購自美國Hyclone公司，Opti-MEM購自美國Gibco公司，pGPU6/RFP/Neo載體購自上海吉瑪制藥技術有限公司。倒置熒光顯微鏡、水浴鍋均購自德國Leica公司，超凈工作臺購自蘇州金凈凈化設備科技有限公司，數顯恒溫水浴鍋購自常州金南儀器制造有限公司，熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組化染色方法及結果判定 采用免疫組化染色法檢測喉癌組織中CrkⅡ蛋白的表達情況，CrkⅡ蛋白主要表達于細胞質，少許表達于細胞核，細胞質和細胞核內出現棕黃色顆粒為陽性細胞[6]。隨機選取5個高倍視野，對陽性染色細胞數量和腫瘤細胞總數進行計算。依據陽性細胞所占百分比評分：≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。依據染色強度評分：無色計0分，淺棕色計1分，棕黃色計2分，深棕色計3分。染色強度評分和陽性細胞所占百分比評分相加，≤3分為陰性表達，＞3分為陽性表達。

1.3.2 CrkⅡRNA干擾質粒構建與驗證 通過NCBI檢索CrkⅡ基因序列，設計干擾小RNA（small interfering RNA，siRNA）序列，基因 ID 為1398，mRNA 序列號為 NM-016823。使用 Invitrogen公司在線設計軟件設計靶向CrkⅡ基因的siRNA干擾序列，依據序列設計原則，經NCBI行BLAST同源對比后，篩選出最優siRNA序列，并設計一條無關序列作為陰性對照。針對CrkⅡ基因的shRNA序列插入至質粒載體內，包含目的基因的序列全部無誤，表明CrkⅡRNA干擾質粒構建成功。

1.3.3 載體選擇與構建 選取pGPU6/RFP/Neo表達載體，此載體內含有Neomycin抗性篩選標記基因和紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）表達基因，以便篩選穩定表達的單克隆細胞系并檢測轉染效率，于Bbsl和BamH1酶切位點插入設計好的siRNA序列，并委托上海吉瑪制藥技術有限公司完成CrkⅡRNA干擾質粒的構建和測序。

1.3.4 細胞培養 ①細胞復蘇：取出凍存的Hep-2細胞，置入預熱（39℃）水浴鍋內，解凍后將細胞懸液吸出，置于離心管內，加入含10%胎牛血清的1640培養基10 ml，選取1支廢棄離心管配平，離心后加入完全培養基，重懸細胞并充分吹打，預防細胞呈團塊，將細胞懸液移至培養瓶內，補充完全培養基，置于培養箱內培養。②細胞傳代：細胞融合至80%時，倒掉舊培養液，立刻加入2 ml無菌PBS，沖洗2次后將1 ml 0.25%胰蛋白酶加入培養瓶，翻轉使細胞與胰蛋白酶充分接觸，于培養箱內培養1 min，巴氏吸管吸取瓶內培養液，反復輕輕吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫落并形成單個細胞懸液，以1∶2或1∶3的比例接種于T25細胞培養瓶內，再置入培養箱內進行培養，第2天換液。③細胞凍存：將完全培養基（含20%胎牛血清）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）按照9∶1的比例制備凍存液，融合度為70%～80%時選取細胞，于倒掉原有培養基的培養瓶中加入2 ml PBS，沖洗2次，PBS洗掉后加入1 ml 0.25%胰蛋白酶，貼壁細胞完全消失后加入培養基，將細胞吹打為單細胞懸液，以2500 r/min的離心速度離心6 min后，去除原培養液和胰蛋白酶，加入至預先配置好的凍存培養液，使用巴氏吸管將細胞吹散為細胞懸液，采用1 ml凍存管分裝。

1.3.5 細胞轉染與分組 將細胞接種至6孔板內，補足2 ml無抗生素完全培養基，確保轉染時融合度為60%～80%，于150 ml無血清培養基Opti-MEM內稀釋4.0 mg NDA，搖勻；于150 ml無血清培養基Opti-MEM內稀釋10 ml LipofectamineTM2000試劑，搖勻后孵育6 min，將稀釋的LipofectamineTM2000試劑加入至質粒稀釋液內，室溫下孵育20 min，將上述轉染復合物加入至各個培養孔內，并上下左右翻轉使細胞與轉染復合物充分接觸，后放置培養箱內培養5 h，去除轉染復合物，加入不含抗生素的完全培養基。將實驗細胞分為空白對照組（無轉染質粒）、陰性對照組（轉染陰性對照質粒）和實驗組（轉染CrkⅡ干擾質粒）。將CrkⅡRNA質粒轉染至Hep-2細胞內，轉染24、48、72 h后，使用倒置熒光鏡觀察RFP的表達情況，細胞呈現紅色熒光表明CrkⅡRNA干擾質粒能夠對Hep-2細胞進行轉染，且Hep-2細胞可穩定表達CrkⅡ。

1.3.6 實時熒光定量PCR檢測CrkⅡmRNA表達情況 轉染后提取細胞總RNA，合成cDNA第一條鏈，行實時PCR擴增，CrkⅡ的上游引物為5'-GATTGAGATGATTTTGGAG-3'，下游引物為5'-GTATGTTAAGTATATGATTG-3'，擴增片段長度是482 bp；內參β-actin的上游引物為5'-CTTGATCGTACGTAGCCTGA-3'，下游引物問5'-GTGTAGTGTACTGTCATGCA-3'，擴增片段長度是 482 bp。42℃預變性，60 min；70℃，15 min；PCR反應條件：94 ℃，45 s；55 ℃，50 s；72 ℃，75 s，共40次循環。

1.3.7 蛋白質印跡法（Western blot）檢測CrkⅡ蛋白表達情況 轉染后提取總蛋白，組織裂解后上樣電泳，初始電壓為80 V，溴酚藍染料前緣進入至分離膠上緣后，提高電壓至100 V，溴酚藍泳出分離膠下緣后電泳結束。采用半干電轉移儀將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜內，以30 mA恒流連續處理90 min。取出PVDF膜后，采用5%TBST脫脂奶粉封閉，振蕩60min。結束封閉后采用TNS-T漂洗液洗膜3次，每次10 min，將膜轉移至雜交袋內，加入適量漂洗液稀釋抗體，封口后于4℃下孵育過夜；用TBST漂洗液洗膜3次，每次10 min，加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，振蕩60 min。PVDF膜置于電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）顯色液內振蕩溫育5 min，暗室下曝光、顯影和定影。清水沖洗后，晾干掃描，采用IPP軟件對掃描圖像的目的條帶行灰度分析。

1.3.8 噻唑藍法檢測Hep-2細胞增殖情況 采集處于對數生長期的細胞，細胞懸液含量為1×104/ml，96孔板接種，倒入200 ml細胞懸液，放入培養箱中培養；然后，每孔內加入劑量為5 mg/ml的噻唑藍（methylthiazolyl tetrazolium，MTT）溶液20 ml，于培養箱內繼續培養4 h；倒掉原MTT培養液，加入DMSO溶解液150 ml，培養板置于搖床振蕩8 min，充分溶解藍紫色結晶甲瓚。于24、48、72 h分別取一塊96板孔，測定各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.3.9 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 于無血清培養液中“饑餓”處理細胞，將細胞重懸計數后稀釋至1×105/ml，接種至Transwell小室中，添加0.5 ml細胞懸液，于24孔板下室加入0.75 ml含10%FBS的完全培養液，培養箱內培養24 h，培養孔內加入1 ml 4%甲醛溶液，固定10 min，PBS洗滌，然后，每孔加入1 ml 0.1%結晶紫溶液，染色30 min，PBS洗滌3次，晾干后置于顯微鏡下觀察。

1.3.10 細胞劃痕實驗檢測Hep-2細胞遷移能力采集細胞并計數，將重懸細胞濃縮至5×105/ml，6板孔內分別加入細胞懸液2 ml，細胞融合度為80%～90%時，采用加樣槍頭在6孔板底中劃痕，PBS沖洗，去除脫落細胞，而后加入培養液，在培養箱中培養。利用軟件測量并計算培養24、48 h后細胞的遷移率。

1.4 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析和重復測量方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CrkⅡ蛋白表達情況的比較

免疫組化染色結果顯示，喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽性表達率為68.52%（74/108），明顯高于癌旁正常組織的9.26%（10/108），差異有統計學意義（χ2=4.157，P＜0.01）。

2.2 不同臨床特征喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的表達情況

臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織分化程度為中低分化、有淋巴結轉移喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽性表達率均高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織分化程度為高分化、無淋巴結轉移的喉癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）；不同年齡、性別喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征的108例喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽性表達情況

2.3 CrkⅡRNA 干擾質粒測序及轉染情況

CrkⅡRNA干擾質粒測序結果顯示，針對CrkⅡ基因的shRNA序列插入至質粒載體內，包含目的基因的序列全部準確無誤，CrkⅡRNA干擾質粒構建成功。CrkⅡRNA轉染至Hep-2細胞內72 h時，Hep-2細胞中可觀察到穩定表達的RFP。

2.4 喉癌細胞Hep-2中CrkⅡmRNA的表達情況

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，空白對照組、陰性對照組、實驗組喉癌細胞Hep-2中CrkⅡmRNA 的表達水平分別為（1.00±0.00）、（1.03±0.02）、（0.52±0.02），3組比較，差異有統計學意義（F=4.097，P＜0.01）。實驗組喉癌細胞Hep-2中CrkⅡmRNA的相對表達量低于陰性、空白對照組，差異均有統計學意義（t=3.498、4.117，P＜0.05）。

2.5 喉癌細胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的表達情況

空白對照組喉癌細胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的相對表達量為（0.84±0.03），陰性對照組喉癌細胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的相對表達量為（0.83±0.04），實驗組喉癌細胞Hep-2中CrkⅡ蛋白的相對表達量為（0.46±0.03），3組比較，差異有統計學意義（F=4.014，P=0.003）。實驗組Hep-2細胞中CrkⅡ蛋白的相對表達量低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統計學意義（t=4.509、5.226，P＜0.05）。

2.6 CrkⅡ蛋白表達下調對Hep-2細胞增殖能力的影響

MTT檢測結果顯示，Hep-2細胞培養24、48、72 h時，3組細胞的OD值比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。實驗組Hep-2細胞不同時間點的OD值均低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

表2 不同組別不同時間點轉染后Hep-2細胞OD值的比較（±s）

表2 不同組別不同時間點轉染后Hep-2細胞OD值的比較（±s）

注：*與實驗組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組實驗組F值P值24 h 0.37±0.01*0.37±0.02*0.33±0.02 3.978 0.015 48 h 0.68±0.02*0.68±0.01*0.57±0.02 5.262 0.009 72 h 0.81±0.01*0.81±0.02*0.68±0.02 4.946 0.010

2.7 CrkⅡ蛋白表達下調對Hep-2細胞侵襲能力的影響

Transwell實驗檢測結果顯示，CrkⅡ蛋白的表達下調后，實驗組穿過基質膜至下室的細胞數目為（98±6），陰性對照組穿過基質膜至下室的細胞數目為（150±7），空白對照組穿過基質膜至下室的細胞數目為（154±6），3組比較，差異均有統計學意義（F=6.294，P＜0.05）。實驗組穿過基質膜至下室的細胞數目低于陰性對照組和空白對照組，差異均有統計學意義（t=4.509、3.921，P＜0.05）。（圖1）

圖1 Transwell 檢測不同組別Hep-2細胞的侵襲能力（SP法染色，×200）

2.8 CrkⅡ基因沉默對Hep-2細胞遷移能力的影響

細胞劃痕實驗檢測結果顯示，轉染24 h時，3組細胞的遷移率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染48 h時，3組細胞的遷移率比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。轉染48 h時，實驗組細胞的遷移率低于陰性對照組、空白對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同組別不同時間點Hep-2細胞遷移率的比較（%，±s）

表3 不同組別不同時間點Hep-2細胞遷移率的比較（%，±s）

注：*與實驗組比較，P＜0.05

組別空白對照組陰性對照組實驗組F值P值24 h 0.21±0.03 0.20±0.04 0.19±0.04 0.418 0.374 48 h 0.61±0.06*0.59±0.07*0.24±0.05 8.153 0.001

3 討論

本研究結果顯示，CrkⅡ蛋白在喉癌組織中高表達，在癌旁正常組織內僅少量表達，說明CrkⅡ蛋白可能與喉鱗狀細胞癌的發生與進展關系密切。本研究中，伴淋巴結轉移、臨床分期高和組織分化程度為中低分化的喉癌患者喉癌組織中CrkⅡ蛋白的陽性表達率較高，說明CrkⅡ蛋白可促進喉癌細胞的生長、侵襲和轉移。基因沉默指的是生物體中特定基因的表達被抑制或不表達的狀況，發生于兩個水平：①轉錄后基因沉默；②位置效應、DNA甲基化和異染色質化等導致轉錄水平內基因不表達[7]。RNAi是序列特異性的、天然的轉錄后基因沉默路徑，廣泛存在于真核生物內[8-10]。本研究采用RNA干擾技術將CrkⅡRNA干擾質粒轉染至Hep-2細胞，而后采用Western blot和實時PCR檢測CrkⅡRNA干擾質粒的干擾效率，結果顯示，實驗組Hep-2細胞中CrkⅡ在蛋白、mRNA水平上的表達水平均低于對照組，說明本研究采用CrkⅡ RNA干擾質粒將CrkⅡ基因成功敲除，使喉癌細胞株Hep-2中CrkⅡ的表達含量降低。

本研究中，MTT檢測結果顯示，實驗組Hep-2細胞的細胞活力低于對照組，且隨著時間的增長，實驗組Hep-2細胞的細胞活力降低得更加明顯，說明CrkⅡ表達下調抑制了Hep-2細胞的增殖能力。為了進一步將質粒和脂質體細胞毒性對細胞所產生的影響進行排除，本研究設立陰性對照組、空白對照組，結果顯示，兩個對照組細胞的增殖情況差異不明顯，說明細胞生長不受質粒與脂質體細胞毒性的影響。劃痕實驗結果顯示，實驗組細胞的遷移率低于陰性對照組、空白對照組，說明CrkⅡ表達下調能夠抑制Hep-2細胞的遷移能力。機體內的細胞遷移過程復雜，主要依賴于細胞外基質重塑、細胞與細胞外基質間附著變化、肌動蛋白細胞骨架協調重建和相關信號調節[11-13]。有研究顯示，整合素信號對p130Cas-Crk-Dock180復合物刺激后可將Racl激活，對形成黏著斑、偽足延伸與肌肉蛋白骨架重塑起調節作用，從而發生細胞遷移[14-15]。所以，整合素信號傳遞受影響與Hep-2細胞內CrkⅡ表達下調后其遷移能力受限可能有關系。Transwell侵襲與遷移實驗結果近似，說明CrkⅡ表達下調后，Hep-2細胞的侵襲能力也下降。研究顯示，腫瘤轉移、侵襲與CrkⅡ蛋白過表達有關，CrkⅡ蛋白過表達可造成腫瘤細胞出現上皮-間充質轉化，CrkⅡ過表達可激活下游效應因子Rap、Rac1，加速細胞擴散，同時CrkⅡ可通過抑制β-連環蛋白與E-鈣粘蛋白的聚集加速上皮黏附連接的分解，進而加速乳腺癌細胞的擴散[16]。同時，RNA干擾所介導的CrkⅡ基因沉默能夠使CrkⅡ表達下調后抑制腫瘤細胞的生長、侵襲與遷移。

綜上所述，喉癌細胞Hep-2中CrkⅡ的表達下調可明顯降低細胞的侵襲、遷移和增殖能力，CrkⅡ蛋白有可能成為喉癌臨床治療中的新靶點。