蚯蚓提取液對家蠶生長發(fā)育及血淋巴氧化指標的影響

吳永勝， 徐麒麟， 楊家棣， 羅紅瓊， 楊 雪， 邱時秀， 孫越鴻， 曹雨辰， 齊桂蘭*

（1.成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所，四川成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川成都 611130；3.樂至縣蠶桑局，四川樂至 641500）

蚯蚓又名地龍，為環(huán)節(jié)動物門寡毛綱的陸棲無脊椎動物，是我國常用中草藥之一。近些年，蚯蚓提取物（液）越來越受到關(guān)注，其富含多種活性成分如蚓激酶、抗菌肽、蚯蚓素等，具有促生長、解熱鎮(zhèn)痛、抗炎抑菌、抗癌等多種功效 （吳澤宇，2015）。研究發(fā)現(xiàn)飲水中添加稀釋300倍的蚯蚓提取物可以提高伊莎佛黑雞育成期的體液免疫水平（李娟，2018）。蚯蚓提取物可提高小鼠的生長性能，降低料重比，提高血清中 T-AOC、IgG、IFN-γ、IL-6、TNF-α、溶菌酶水平，進而提高小鼠的免疫功能（劉瀚揚，2019）。飼糧中添加蚯蚓提取物可以降低成華豬的料重比，促進蛋白質(zhì)的合成及利用，降低血清LDH和促炎因子IL-6水平，進而提高機體的抗氧化能力和免疫功能（徐麒麟，2019）。

家蠶（Bombyx mori）是一種重要的經(jīng)濟昆蟲，為絲綢產(chǎn)業(yè)提供重要的原料，繭絲產(chǎn)量是蠶業(yè)生產(chǎn)中最關(guān)注的問題（朱巧瑩，2015）。桑是家蠶的主要飼料，家蠶5齡期的食桑量占全齡食桑量的85%（王安皆，2008）。桑葉為家蠶提供生長發(fā)育及絲蛋白合成所需的營養(yǎng)物質(zhì)，越來越多的學(xué)者用中草藥提取液（高玉軍，2018）、殺蟲劑（李二蘭，2016）或重金屬（袁紅霞，2014）等處理桑葉來研究其對家蠶生長發(fā)育、繭絲質(zhì)量的影響，并深入開展相關(guān)機理研究。然而目前鮮見蚯蚓提取液對家蠶生長發(fā)育及血淋巴氧化指標的影響，因此本試驗用不同稀釋比例的蚯蚓提取液原液處理桑葉，初步探究其對家蠶生長發(fā)育、蠶繭質(zhì)量、蠶絲品質(zhì)及血淋巴中氧化關(guān)鍵指標的影響，旨在為蚯蚓提取液的生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗于2018年春季蠶期在成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所進行。供試品種為871×872，由樂至縣蠶桑局提供，1～4齡幼蟲常規(guī)桑葉育。

蚯蚓提取液原液由成都市農(nóng)林科學(xué)院畜牧研究所研制，蚯蚓為人工飼養(yǎng)的赤子愛勝蚓（Eisenia foetida），蚯蚓提取液用蒸餾水混勻，經(jīng)自融水解后制備，經(jīng)檢測分析，所制備的蚯蚓提取液原液密度1.048 g/mL，其中氨基酸總量（17種）5.42%、游離氨基酸2.97%、SOD 1289 IU/mL、小肽6.95%，蚯蚓提取液原液置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 苯基硫脲購自Sigma-Aldrich公司，丙二醛、乳酸脫氫酶和總抗氧化能力試劑盒購自北京奇松生物科技有限公司。

1.3 試驗設(shè)計 5齡期家蠶幼蟲隨機分為4個組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)100頭。設(shè)置3個蚯蚓提取液原液稀釋比例組（EE1、EE2和 EE3），稀釋比例分別為50倍、100倍和200倍，蚯蚓提取液原液按比例稀釋后按50 mL/kg噴灑新鮮桑葉，稍晾干后給家蠶添食，對照組（CK）則用蒸餾水代替。5齡期家蠶幼蟲饑餓4 h后開始添食，每8 h添食一次，進入熟蠶期終止添食，正常條件下上簇營繭。

1.4 指標檢測

1.4.1 家蠶生長指標 在家蠶飼養(yǎng)期間，每天觀察各組家蠶的基本活動，調(diào)查家蠶的蠶體質(zhì)量及存活率，并及時將死亡幼蟲移除。

1.4.2 繭質(zhì)及絲質(zhì) 在各組家蠶全部上簇7 d后采繭，從每個重復(fù)中隨機抽取雌雄繭各10粒，剖繭，分別稱量全繭量、繭層量，計算繭層率；從各處理組中稱取繅絲測定材料繭1.5 kg，委托四川省農(nóng)科院蠶業(yè)研究所檢測絲質(zhì)相關(guān)指標。

1.4.3 血淋巴氧化指標 5齡期第7天，每個重復(fù)隨機選取家蠶幼蟲各10頭，用脫脂棉蘸取75%的酒精對家蠶蠶體進行體表消毒，剪去尾角，輕壓腹部采集血淋巴于冰浴的離心管中，加入少量苯基硫脲后4℃、8000 r/min離心10 min，取上清置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肊LISA試劑盒檢測家蠶血淋巴中丙二醛、乳酸脫氫酶、總抗氧化能力水平。具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行，每個樣品重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS 9.2統(tǒng)計分析軟件中的MEANS過程進行描述性統(tǒng)計分析，ANOVA過程進行方差分析和Duncan’s多重比較，結(jié)果用“平均值±標準差”表示。P＜0.05表示差異顯著，采用GraphPad Prism6軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 蚯蚓提取液對家蠶體質(zhì)量和存活率的影響由表1可知，與對照組相比，添食蚯蚓提取液稀釋的桑葉可提高家蠶的體質(zhì)量和存活率。50倍稀釋組體質(zhì)量和存活率均顯著高于對照組（P＜0.05），100和200倍稀釋組體質(zhì)量顯著高于對照組（P＜0.05），但存活率與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）。

表1 蚯蚓提取液對家蠶5齡幼蟲體質(zhì)量和存活率的影響

2.2 蚯蚓提取液對家蠶繭質(zhì)的影響 由表2可知，與對照組相比，添食蚯蚓提取液稀釋的桑葉對蠶繭全繭量、繭層量和繭層率無顯著影響（P＞0.05）。

表2 蚯蚓提取液對家蠶5齡幼蟲繭質(zhì)的影響

2.3 蚯蚓提取液對家蠶絲質(zhì)的影響 由表3可知，與對照組相比，添食蚯蚓提取液稀釋的桑葉組蠶絲品質(zhì)均有提高。與對照組相比，50、100和200倍稀釋組粒繭絲長分別增加了68.1、10.9 m和15.1 m；100和200倍稀釋組解舒率分別增加了3.7%和1.9%；50和200倍稀釋組繭絲纖度降低了0.084、0.035旦，100倍稀釋組繭絲纖度增加了0.049旦；50、100和200倍稀釋組解舒絲長分別增加了52.7、46.4 m和31.8 m；50和100倍稀釋組出絲率分別增加了1.6%和1.3%；50、100和200倍稀釋組蠶絲潔凈分別增加了3.12、3.75、1.25 分。

2.4 蚯蚓提取液對家蠶血淋巴氧化指標的影響由圖1可知，家蠶5齡期幼蟲添食蚯蚓提取液稀釋后處理的桑葉，血淋巴中氧化關(guān)鍵指標丙二醛含量和乳酸脫氫酶含量均有降低。其中，100和200倍稀釋組血淋巴中丙二醛含量與對照組相比分別降低了38.04%和32.23%（P＜0.05），乳酸脫氫酶含量分別降低了25.65%和35.60%（P＜0.05），50倍稀釋組丙二醛和乳酸脫氫酶含量與對照組相比差異不顯著（P＞0.05）；各稀釋組血淋巴總抗氧化能力差異不顯著（P＞0.05）。

表3 蚯蚓提取液對家蠶絲質(zhì)的影響

3 討論

本試驗結(jié)果表明，家蠶5齡幼蟲期添食不同稀釋比例的蚯蚓提取液后，體質(zhì)量、存活率及絲質(zhì)均有所提高，表明蚯蚓提取液可促進家蠶的生長發(fā)育。ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，100和200倍蚯蚓提取液稀釋組家蠶血淋巴中氧化損傷指標丙二醛和乳酸脫氫酶的水平均有所降低，表明其可以間接提高家蠶的的抗氧化損傷能力。

蚯蚓提取液是從蚯蚓體內(nèi)提取的混合物，研究表明其具有重要的促生長作用，是一種生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。謝大識等（2008）研究發(fā)現(xiàn)日常飲水中添加0.5%和1.5%的蚯蚓提取物后肉雞的增重效果明顯。孫朋朋等（2014）研究表明，仔豬補充料中加入蚯蚓液可促進仔豬生長發(fā)育，提高斷奶重。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，添食蚯蚓提取液稀釋的桑葉可明顯提高家蠶的體質(zhì)量和存活率。這與覃明和等（1988）前期的研究結(jié)果相一致。本試驗同時研究發(fā)現(xiàn)，添食蚯蚓提取液對家蠶全繭量、繭層量和繭層率等繭質(zhì)指標沒有顯著影響，但可以提高蠶絲的品質(zhì)，而覃明和（1989）研究發(fā)現(xiàn)蚯蚓提取液具有增強體質(zhì)，促進絲蛋白積累的作用，其主要經(jīng)濟指標全繭量、繭層量和繭層率均有提高，同時繭層氨基酸總量及構(gòu)成繭絲蛋白的主要氨基酸含量均有提高，這可能與家蠶品種、試驗環(huán)境及蚯蚓提取液有關(guān)。

丙二醛是膜脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，其水平間接反映機體損傷程度，丙二醛水平升高可使生物膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)，并且通過脂氫過氧化物的分解產(chǎn)物引起細胞損傷，導(dǎo)致細胞膜構(gòu)型、結(jié)構(gòu)和通透性改變，進而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激（米智，2013）。本試驗結(jié)果顯示，添食蚯蚓提取液可降低家蠶血淋巴中丙二醛的含量，這與周億金等（2009）在小鼠血液和肝臟中的研究結(jié)果一致。乳酸脫氫酶是一種細胞質(zhì)氧化還原酶，可催化乳酸氧化為丙酮酸，是機體病理損傷、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的標志，其水平常常用于細胞和組織毒理學(xué)領(lǐng)域和臨床生物學(xué)診斷（Akila，2017）。本試驗結(jié)果顯示，添食蚯蚓提取液可降低家蠶血淋巴中乳酸脫氫酶的含量，這與徐麒麟等（2019）在成華豬上的研究結(jié)果一致。總抗氧化能力反映了機體清除活性氧的能力，蚯蚓提取液對動物機體總抗氧化能力存在差異性。我們實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加蚯蚓提取液可以提高小鼠血清中總抗氧化能力，但蚯蚓提取液對成華豬血清中的總抗氧化能力卻沒有影響。而本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)添食蚯蚓提取液對家蠶血淋巴中總抗氧化能力沒有影響，這一結(jié)果表明蚯蚓提取液對動物的總抗氧化能力的影響可能與動物種屬有關(guān)。

本研究證實了添食蚯蚓提取液稀釋處理后的桑葉可促進家蠶的生長發(fā)育，間接提高家蠶的抗氧化損傷能力。為蚯蚓提取液在家蠶生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了參考。但是，其分子機制仍有待進一步研究。