大豆異黃酮對高溫下體外培養奶牛乳腺上皮細胞增殖和抗氧化能力的影響

姜淑妍

（長春職業技術學院，吉林長春 130504）

大豆異黃酮是從大豆中提取的次生代謝產物，表現弱雌激素樣作用，具有抗氧化、抗腫瘤等生理功能（徐春華等，2010）。郝振榮等（2010）研究發現，在奶牛的日糧中添加大豆異黃酮能夠增強奶牛的免疫功能，提高奶牛泌乳性能。方洛云等（2015）也研究發現，大豆異黃酮能夠提高奶牛體內的抗氧化酶活性，改善奶牛的產奶性能。以上結果說明，大豆異黃酮能夠作為一種添加劑在奶牛上應用。乳腺上皮細胞是合成和分泌乳汁的主要場所，奶牛對高溫較敏感，當環境溫度過高時，就會激活Caspase-3活性，誘導乳腺上皮細胞凋亡，從而降低產奶量和乳品質（張響英等，2017）。研究發現，培養基中添加10、100、1000 mg/L大豆異黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細胞的增殖和泌乳性能，增強細胞的抗氧化能力（穆瑩和江連洲，2013；盧志勇等，2013）。目前，研究大豆異黃酮對高溫下體外培養奶牛乳腺上皮細胞的影響還鮮見報道。權素玉等（2016）研究發現，奶牛乳腺上皮細胞在42℃高溫下1.5 h內細胞活率持續降低，2 h后開始恢復。說明高溫處理2 h后細胞逐漸適應高溫環境，存活率短期內不再下降。因此，本試驗擬在42℃高溫處理1.5 h下，研究大豆異黃酮對奶牛乳腺上皮增殖和抗氧化的影響，目的是了解大豆異黃酮能否緩解高溫對奶牛乳腺上皮細胞的損傷。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 奶牛選用吉林九臺廣源牧業有限公司荷斯坦奶牛；純度為98%的大豆異黃酮購于大連綠峰食品有限公司。奶牛乳腺上皮細胞采用組織塊法培養。無菌條件下剪取健康荷斯坦奶牛的乳腺組織，清除脂肪，剪成小塊（1 mm3）接種培養，然后參照狄和雙等（2006）方法進行細胞的分離、培養和純化。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞活性 將1×104個奶牛乳腺上皮細胞接種于96孔板中，分為4組，每組基礎培養基中分別加 0、10、100 μg/mL 和 1000 μg/mL 大豆異黃酮，每組8個重復。大豆異黃酮溶于二甲基亞砜（DMSO），其中DMSO含量為1.5‰。細胞在37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，再在42℃、5%CO2培養箱中培養 1.5 h，然后在 37℃、5%CO2培養箱中培養12 h后去除培養液，分別每孔加入培養基100 μL和10 μL CCK-8溶液，在培養箱中孵育3 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光值，然后根據試劑盒說明書上的公式計算細胞相對活性。

1.2.2 抗氧化指標的測定 將1×105個/mL的奶牛乳腺上皮細胞接種到12孔板，試驗分組同上，每組4個重復。細胞在37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，再在42℃、5%CO2培養箱中培養1.5 h，然后在37℃、5%CO2培養箱中培養12 h后收集細胞，然后使用南京建成試劑盒檢測乳酸脫氫酶（LDH）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性和一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量。操作步驟和檢測方法按照試劑盒的說明書進行。

1.2.3 活性氧（ROS）的檢測 將 1×105個/mL的奶牛乳腺上皮細胞接種到12孔板，試驗分組同上，每組4個重復。細胞在37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，再在42℃、5%CO2培養箱中培養1.5 h，然后在37℃、5%CO2培養箱中培養12 h后收集細胞，細胞按照南京建成試劑盒上的方法進行處理后用流式細胞儀進行檢測。

1.2.4 基因表達的測定 將5×105個/mL的奶牛乳腺上皮細胞接種到6孔板，試驗分組同上，每組4個重復。細胞在37℃、5%CO2培養箱中培養48 h后，再在42℃、5%CO2培養箱中培養1.5 h，然后在37℃、5%CO2培養箱中培養12 h后去除培養基，根據Qiagen試劑盒中的說明書進行提取RNA，檢測濃度和純度后反轉錄成cDNA。按照Takara熒光定量PCR試劑盒說明書上步驟進行操作，然后在Bio-Rad PCR儀上進行基因表達的檢測。被檢測的基因引物根據Gene Bank中序列進行設計，并由上海生工公司合成。引物設計見表1。

表1 引物設計

1.3 數據分析 先將數據用Excle 2010進行預處理，結果用“平均值±標準差”表示，然后用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析 （ANOVA），采用LSD法進行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 大豆異黃酮對奶牛乳腺上皮細胞活性的影響 由表2可知，與0 μg/mL組相比，高溫培養下添加100 μg/mL和1000 μg/mL大豆異黃酮能夠顯著提高奶牛乳腺上皮細胞活性（P＜0.05），其中1000 μg/mL組細胞活性最高。結果表明，大豆異黃酮能夠促進奶牛乳腺上皮細胞的增殖。

表2 大豆異黃酮對奶牛乳腺上皮細胞活性的影響

2.2 大豆異黃酮對細胞活性氧水平的影響 由表3可知，與0 μg/mL組相比，高溫培養下添加10～1000 μg/mL大豆異黃酮能夠顯著降低奶牛乳腺上皮細胞活性氧的濃度（P＜0.05），且活性氧濃度隨著大豆異黃酮添加水平的升高而顯著下降（P＜0.05）。結果表明，大豆異黃酮能夠抑制奶牛乳腺上皮細胞活性氧的產生。

表3 大豆異黃酮對奶牛乳腺上皮細胞活性氧水平的影響

2.3 大豆異黃酮對細胞抗氧化能力的影響 由表 4 可知，高溫培養下，100 μg/mL 和 1000 μg/mL大豆異黃酮組奶牛乳腺上皮細胞的GSH-Px活性顯著高于 0 μg/mL 和 10 μg/mL 組 （P ＜ 0.05），而NO濃度則相反。細胞的CAT活性隨著培養基中大豆異黃酮添加水平的升高而顯著升高 （P＜0.05），LDH活性隨大豆異黃酮添加水平的升高而顯著降低 （P＜0.05）。 與0 μg/mL組相比， 添加10～1000 μg/mL大豆異黃酮組細胞的SOD活性顯著升高（P＜0.05），MDA的濃度顯著降低（P ＜0.05）。結果表明，大豆異黃酮能夠提高奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化能力。

表4 大豆異黃酮對奶牛乳腺上皮細胞抗氧化能力的影響

2.4 大豆異黃酮對細胞凋亡基因的影響 由表5可知，與0 μg/mL組相比，高溫培養下添加100 μg/mL和1000 μg/mL大豆異黃酮能夠顯著降低奶牛乳腺上皮細胞內Caspase3和Bax基因的相對表達（P＜0.05），但能夠顯著升高細胞內Bcl-2基因的相對表達（P＜0.05）。結果表明，大豆異黃酮能夠抑制奶牛乳腺上皮細胞的凋亡。

表5 大豆異黃酮對奶牛乳腺上皮細胞凋亡基因的影響

3 討論

大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類生物活性物質，其結構形式是3-苯并吡喃酮為母核的化合物，屬于黃酮類化合物。研究發現，黃酮類物質如大豆黃酮和槲皮素均能夠提高奶牛乳腺上皮細胞的活性（陳靜，2012；劉春龍等，2008）。 說明黃酮類物質有促進細胞增殖的作用。42℃高溫處理下，引起氧化應激，導致奶牛乳腺上皮細胞生長受阻，成活率降低，細胞凋亡率升高（權素玉等，2016；周振峰等，2010）。說明熱應激能夠促進奶牛乳腺上皮細胞的凋亡。有人認為，熱應激能夠升高心肌細胞活性氧濃度，進而導致細胞凋亡 （宋學立等，2000）。機體在高溫下會導致體內氧化還原系統失衡，抗氧化酶類活性下降，促使體內活性氧升高，從而造成氧化應激（苗啟翔等，2019）。本試驗中，在高溫下，奶牛乳腺上皮細胞中的活性氧濃度隨著大豆異黃酮添加水平的提高顯著降低，而細胞的相對活性顯著升高；添加100～1000 μg/mL的大豆異黃酮能夠提高細胞的谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性，降低乳酸脫氫酶活性以及一氧化氮和丙二醛含量。結果說明，大豆異黃酮能夠通過提高細胞的抗氧化酶類的活性，降低細胞活性氧濃度，進而抑制高溫對奶牛乳腺上皮細胞的氧化損傷，促進細胞的增殖。

Caspase家族中的Caspases3是細胞程序性死亡的介導者和執行者，在正常情況下，其以無活性的酶原形式存在于胞漿中，當被激活時，會引起細胞凋亡（趙瑞杰等，2010）。在高溫刺激下會導致細胞內活性氧升高，當活性氧積累到一定水平就會導致Bax表達和Caspase活化；而Bcl-2能夠影響細胞內質網內鈣離子的釋放，抑制自由基的產生以及與Bax結合來抑制細胞凋亡 （王彤等，2008）。在本試驗中，高溫刺激下，添加100～1000 μg/mL大豆異黃酮能夠降低Caspases-3和Bax的表達，升高Bcl-2的表達。結果說明，大豆異黃酮能夠緩解高溫促奶牛乳腺上皮細胞凋亡的作用。

4 結論

培養基中添加100～1000 μg/mL大豆異黃酮能夠通過提高細胞的抗氧化能力，降低細胞內活性氧水平，下調Caspases3和Bax的表達，上調Bcl-2的表達，進而抑制奶牛乳腺上皮細胞的凋亡，促進細胞增殖。