五種植物精油對(duì)鴨疫里默氏菌體外抑菌效果觀察

左春生， 徐光科， 焦鳳超， 李迎曉， 吳海港， 何 敏， 黃 立， 趙 聘

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院/河南省水禽資源開發(fā)利用與疫病防控工程技術(shù)研究中心，河南信陽(yáng)464000）

鴨疫里默氏菌（RA）可感染鴨、鵝、火雞等多種禽類，病原體可引起以漿膜炎為特征的敗血性疾病，又稱鴨傳染性漿膜炎，可導(dǎo)致高死亡率和顯著性經(jīng)濟(jì)損失（Jiakai Sundd 等，2019）。

隨著各類抗生素和化學(xué)合成藥物的普遍使用，越來(lái)越多的鴨疫里默氏菌耐藥菌株產(chǎn)生，并且藥物殘留問題給畜牧業(yè)和人類健康帶來(lái)了巨大的危害。2013—2018年分離的137株耐藥菌中，共檢測(cè)到162個(gè)耐藥菌株的高頻突變位點(diǎn)，分析結(jié)果顯示，只在GyrA發(fā)生Ser83Ile突變的菌株MIC值增加了8～16倍，所有突變菌株均對(duì)氨芐西林、孢噻呋、喹諾酮 、氨基糖甙耐藥 （Zhu等，2019；朱元軍等，2019）。

植物精油是一種綠色、安全的植物源性藥物，具有抗菌、增強(qiáng)免疫力、提高應(yīng)激及改善生產(chǎn)性能的優(yōu)點(diǎn)，是目前新型飼料添加劑研發(fā)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。其作為抗生素的替代品運(yùn)用到畜禽生產(chǎn)上具有很大的潛力。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者的不斷研究，植物精油的應(yīng)用也在日益加深，其在醫(yī)學(xué)方面、植物保護(hù)、食品行業(yè)以及日化產(chǎn)品中扮演著越來(lái)越重要的角色（劉濤等，2009；丁玉軍等，2009；張萬(wàn)里等，2009；李有志等，2007；杜傳來(lái)等，2004）。 本文以探討五種植物精油對(duì)鴨疫里默氏菌的體外抑菌效果為研究目的，為防治鴨疫里默氏菌病天然藥物開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 桉葉油，桉葉素≥70.0%；紫蘇油相，紫蘇醛≥25.0%；陳皮油，檸檬烯≥86.0%；薄荷油，總醇量（以薄荷醇計(jì)）≥79.0；肉桂油，肉桂荃≥71%（四川恒瑞通達(dá)提供）。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基 RA血清1型標(biāo)準(zhǔn)菌株由上海獸醫(yī)研究所胡青海博士惠贈(zèng)。質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。TSA瓊脂培養(yǎng)基、TSB培養(yǎng)基購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 Tu1810分光光度計(jì)、20334008電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；LHP-400恒溫培養(yǎng)箱、LB-111B恒溫培養(yǎng)搖床，常州潤(rùn)華電器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的復(fù)蘇與鑒定 將保存的菌株稀釋后劃線接種于TSA平板，置于燭缸中37℃培養(yǎng)36 h，挑取可疑菌落轉(zhuǎn)接種TSA培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）純培養(yǎng)后，革蘭氏染色和瑞氏染色后檢查細(xì)菌形態(tài)。挑取TSA培養(yǎng)基純化后的單菌落轉(zhuǎn)接種TSB培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）增菌培養(yǎng)后待用。

1.2.2 接種培養(yǎng) 挑取一接種環(huán)平板菌分別接入5 mL相應(yīng)的液體肉湯培養(yǎng)基中，置恒溫振蕩器（轉(zhuǎn)速為200 r/min）37℃振蕩培養(yǎng)24 h后，以2%的接種量分別接種到100 mL 37℃預(yù)熱的TSA中，搖勻后，分裝于12支試管中置氣浴恒溫振蕩器，37℃振蕩培養(yǎng)，此一時(shí)間設(shè)為0。然后在不同時(shí)間間隔內(nèi)（表1），任取一管液體培養(yǎng)物以無(wú)菌生理鹽水連續(xù)作10倍稀釋，采用平板表面涂布計(jì)數(shù)法，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

按各試管號(hào)的時(shí)間取菌液，取稀釋的后三個(gè)稀釋度，準(zhǔn)確吸取50 μL均勻涂布到滅菌后的固體培養(yǎng)基上，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做三個(gè)平行瓊脂平板，在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h，然后計(jì)數(shù)（一般菌落數(shù)在30～300個(gè)為宜，50個(gè)左右最好）。

1.2.3 細(xì)菌計(jì)數(shù) 細(xì)菌計(jì)數(shù)按農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的獸醫(yī)生物制品規(guī)程進(jìn)行。即分別將TSB培養(yǎng)物進(jìn)行 10、102、103、104、105倍稀釋， 然后取 0.1 mL 的稀釋液接種TSA平板，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平板，置蠟燭罐中，37℃培養(yǎng)24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，兩個(gè)平板上菌落的平均數(shù)即為該稀釋度的細(xì)菌數(shù)，再按稀釋度計(jì)算每毫升菌液的細(xì)菌含量。

1.2.4 生長(zhǎng)曲線測(cè)定 以每毫升cfu log10對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別繪制三種培養(yǎng)基增菌的生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 菌懸液的制備 用滅菌水將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌落洗下制成菌懸液,再用生理鹽水把制備好的菌懸液以10倍比稀釋，使菌液的濃度為105～106cfu/mL。放在4℃冰箱保存或立即接種培養(yǎng)（蔡紅等，2013；郎利敏，2011）。

1.2.6 精油藥敏片的制備 每瓶放100個(gè)6 mm大小的濾紙片，分別加入300 μL桉葉油、紫蘇油、陳皮油、薄荷葉油，對(duì)照組加入等量生理鹽水，浸泡30 min。無(wú)菌條件下，分別將浸有不同植物精油的藥敏片貼到涂布有菌懸液的TSA培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)24 h，每種精油設(shè)置2個(gè)平行試驗(yàn)。

1.2.7 最小抑菌濃度的測(cè)定 精油配制：取50 μL不同的植物精油用70%乙醇定容到5 mL，即將其稀釋成1%（V/V）的精油原液。用蒸餾水將以上的精油原液采用倍比稀釋法稀釋到0.0625%備用。測(cè)定方法：以桉葉油為例，取裝有2.5 mL TSB培養(yǎng)基的試管12個(gè)并依次標(biāo)號(hào)，向1號(hào)試管加入2.5 mL上述配制的精油原液，充分吹吸均勻，再?gòu)牡谝还苤形?.5 mL液體加到2號(hào)試管中，重復(fù)上述步驟，吹吸均勻后吸取2.5 mL于3號(hào)試管中，第10號(hào)試管的液體棄去；然后向1到10號(hào)試管里各加入100 μL的菌懸液，11號(hào)試管只加精油不加菌懸液，12號(hào)試管不加精油只加菌懸液，作為對(duì)照組。置于燭缸中37℃培養(yǎng)24 h，分光光度計(jì)600 mm可見光測(cè)量各管的濁度，測(cè)定精油對(duì)鴨疫里默氏菌的最小抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨疫里默氏菌生長(zhǎng)情況 鴨疫里默氏菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析如表1和圖1所示。

2.2 每種植物精油對(duì)鴨疫里默氏菌的敏感性將貼過藥敏片的培養(yǎng)基于燭缸中37℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈的大小，然后再用游標(biāo)卡尺測(cè)定每個(gè)抑菌圈的直徑，重復(fù)三次，計(jì)算每種精油抑菌圈的平均值。抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥；10～15 mm為低度敏感；16～20 mm為中度敏感；20 mm以上為高度敏感。試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 精油敏感性判定

2.3 精油對(duì)鴨疫里默氏菌的最小抑菌濃度測(cè)定由表3可知，桉葉油、肉桂油、陳皮油、紫蘇油、薄荷油分別在第 4、3、4、3、2 管 OD 值急速增大，MIC 分 別 為 78.12、156.24、78.12、156.24、312.5 μL/L。綜合評(píng)定五種精油對(duì)鴨疫里默氏菌的抑菌效果分別是桉葉油＞肉桂油＞陳皮油＞紫蘇油＞薄荷油。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)過程中由于精油原液顏色不同與肉湯混合后會(huì)有不同程度的渾濁；不同稀釋度精油混合肉湯產(chǎn)生輕微乳濁樣，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的觀察造成困擾。采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)管的濁度，取得各管培養(yǎng)前后OD的變化值可減小試驗(yàn)誤差。

研究表明，肉桂醛對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌 、黃色葡萄球菌、鏈球菌具有較強(qiáng)的抑菌效果 （袁瑤等，2019；王康莉等，2019）

陳林林（2010）發(fā)現(xiàn)，柑橘皮精油對(duì)大腸桿菌、白色葡萄球菌和青霉均有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)大腸桿菌的抑菌作用最強(qiáng)；紫蘇葉油化學(xué)成分的研究表明其主要成分為紫蘇醛，還有少量的檸檬烯及少量α一蒎烯等。張子揚(yáng)等（1990）對(duì)紫蘇葉油進(jìn)行的抑菌性試驗(yàn)結(jié)果表明，紫蘇葉揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為500 μg/mL；王紅星等（1996）發(fā)現(xiàn)，桉葉油的主要成分沒食子酸有明顯的抑菌效果；周露等（2011）研究了薄荷精油對(duì)大腸桿菌、金黃葡萄球菌、煙曲白色念珠菌的抗菌活性，結(jié)果顯示薄荷精油對(duì)大腸桿菌、金霉菌、白色念珠菌有明顯的抗菌活性。

關(guān)于精油對(duì)鴨疫里默氏菌體外抑菌試驗(yàn)，國(guó)內(nèi)鮮見報(bào)道。另外精油提取原料選材、提取工藝、有效成分、抑菌機(jī)理或?qū)喴呃锬暇〉闹委熜Ч行柽M(jìn)一步深入研究。

表3 桉葉油對(duì)鴨疫里默氏菌的抑菌性測(cè)定數(shù)據(jù)