菊芋全粉與地衣芽孢桿菌對凡納濱對蝦生長性能、免疫能力及腸道菌群變化的影響

孟現堯 ， 朱曉振 ， 賈晨晨 ， 衣悅濤

（1.中國科學院煙臺海岸帶研究所，山東煙臺 264003；2.中國科學院大學，北京 100049；3.中國科學院海洋大科學研究中心，山東青島266071）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）是世界最主要的養殖對蝦品種，也是我國最大的水產品出口品種；同時對蝦養殖業也是我國水產養殖業的支柱性產業（陳學洲等，2016）。目前，我國凡納濱對蝦的年產量約為150萬噸。但是由于凡納濱對蝦缺乏特異性免疫，在大規模高密度養殖模式下極易感染蝦病，死亡率極高，2017年全國平均養殖成功率僅有20% ～30%（陳建等，2018）。這嚴重制約了對蝦養殖業的健康發展。

當使用抗生素不能有效控制疫情，并且造成了嚴重的環境污染，進而加速耐藥菌株產生的問題后（謝達堯，2018；陳燕軍，2007）。為了改善對蝦的抗病性，減少抗生素的使用，利用益生元、益生菌完善對蝦腸道健康成為一種效果良好的新方法。研究表明，益生菌可以改善水體，促進水產動物生長，抑制致病菌，強化宿主先天免疫（Farzanfar等，2010）；而益生元可以通過促進益生菌的增殖來提高飼料轉化率，改善黏膜屏障修復細胞損傷，調節腸道菌群平衡，提高抗病力 （Ringo/等，2010）。地衣芽孢桿菌因為可以提供營養物質，并且具有促進生長，調節腸道微生物平衡，增強機體免疫力，改善水質等作用，而廣泛應用為飼料添加劑（袁慧坤等，2019）。菊粉是一種水溶性益生元，具有調節腸道微生態平衡，提高宿主非特異性免疫等功能。菊芋全粉成本更低，微溶于水，含有50%以上的菊粉。所以本試驗選擇菊芋全粉和地衣芽孢桿菌為飼料添加劑應用于對蝦養殖中，研究其對凡納濱對蝦生長性能、免疫應答以及腸道菌群變化的影響。以期為菊芋全粉和地衣芽孢桿菌在對蝦健康養殖上的聯合應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 試驗所用凡納濱對蝦來自山東東方海洋科技股份有限公司，初始平均體重為（0.9±0.1）g。在中國科學院牟平海岸帶環境綜合試驗站，使用 200 L塑料水箱飼養，水溫（28±1）℃，pH 8.1，鹽度 30‰。 每天投喂 4 次（7：30、11：00、17：00、21：00），投喂量為對蝦體重的 5%，若沒有食物殘渣剩余，則第二日飼料投喂量增加20%。每日及時清除糞便與食物殘渣，換水80%，暫養一周后用于試驗。

1.2 試驗設計 暫養結束后，挑選1200尾健康對蝦，隨機分為4組，每組3個平行，每個平行100尾對蝦。對照A組喂食基礎飼料，試驗B、C、D組分別在基礎飼料中添加1%菊芋全粉、108cfu/g地衣芽孢桿菌和1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌，飼養周期為4周。基礎飼料為煙臺遠景生物技術有限公司的對蝦飼料原料，按配比混勻后加水揉勻，擠壓造粒，自然晾干。營養水平如表1所示。

表1 基礎飼料營養成分%

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長性能測定 試驗前記錄平均初重W0，初始尾數N0。飼養四周后，各組對蝦禁食24 h，記錄最終平均體重 Wt，最終尾數 Nt。 成活率（SR）、特殊生長率（SGR）、飼料轉化率（FCR）計算公式如下：

式中：T為飼養試驗天數，d；F為對蝦的攝食總量，g。

1.3.2 血細胞計數及呼吸爆發測定

1.3.2.1 血細胞計數 （THC） 試驗結束后，取3只對蝦血淋巴與抗凝劑 （0.02 moL EGTA，0.48 moL NaCl，0.019 moL KCl和.068 moL Tris-HCl，pH 7.6）1：1混合制成細胞懸液，在光學顯微鏡下通過血球計數板計數。

1.3.2.2 呼吸爆發 （RB） 將細胞懸液按照Hong等（2006）的適當調整后測量巨噬細胞呼吸爆發。

1.3.3 血淋巴免疫因子活性測定 將對蝦在冰盤上用1 mL針筒在頭胸甲處取血淋巴，在4℃、3000 r/min下離心10 min，取上清-80℃保存，用作血淋巴免疫指標的測定。對蝦血淋巴的總抗氧化能力（T-AOC）和溶菌酶（LZM）使用南京建成公司試劑盒測定。

1.3.4 腸道微生物分析 在冰盤上取出蝦線，無菌水清洗，-20℃保存，送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序和生物信息學分析。根據16S rRNA基因V3～V4區序列設計如下引物：正向引物338F 5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；806R 5’ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。原始數據濾掉低質量序列后得到有效數據，進行OTUs（Operational Taxonomic Units） 聚類，分析微生物α多樣性（Chao指數、Shannon指數及Simpson指數）、β多樣性和微生物群落組成、豐富度，發掘不同試驗組之間的差異。

1.4 數據處理與分析 數據用 SPSS 18軟件進行單素方差分析（One-way ANOVA），結果以“平均值±標準差”表示，當P＜0.05時為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦生長性能的影響 由表2可知，與基礎飼料對照A組相比，所有試驗組的最終體重和特殊生長率都沒有顯著性差異（P＞0.05）。另外，108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗C組存活率顯著高于對照A組 （P＜0.05）；1%菊芋全粉試驗B組和108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗C組同對照A組相比，飼料利用率顯著提高（P＜0.05）。

表2 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦生長性能的影響

2.2 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦免疫能力的影響

2.2.1 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦THC的影響 由圖1可知，與對照A組（0.35×106/mL）相比，1%菊芋全粉試驗 B 組（0.44×106/mL）與 108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗C組（0.86×106/mL）血細胞數目沒有顯著性差異 （P＞0.05），1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗D組（1.17×106/mL）具有顯著性差異（P ＜ 0.05）。

2.2.2 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦RB的影響 如圖2所示，108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗C組與1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗D組RB相對值（1.43、1.90）較對照A組顯著提高（P＜0.05），但試驗C、D組之間沒有顯著性差異（P ＞ 0.05）。

2.2.3 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦血淋巴免疫因子應答的影響 由圖3可知，與基礎飼料對照A組（0.24 U/mL）相比，所有試驗組T-AOC活性 （0.38、0.32、0.39 U/mL） 都顯著提高 （P ＜0.05），且不同試驗組之間沒有顯著性差異，其中以1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗D組T-AOC活性最高。如圖4所示，與基礎飼料對照A組（70.69 U/mL）相比，所有試驗組LZM活性（108.82、145.81、135.24 U/mL）都顯著提高 （P ＜0.05），以108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗C組LZM活性最高，不同試驗組之間沒有顯著性差異。

2.3 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦腸道微生物的影響

2.3.1 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦腸道微生物α多樣性的影響 經過四周的養殖試驗，分析各試驗組對蝦的腸道菌群變化。試驗組平均有（51937±2953）個高質量的序列，這些序列可以聚類成1126個特殊的操作分類學單位（OTUs，序列標識97%）。圖5～7顯示，添加菊芋全粉與地衣芽孢桿菌后，凡納濱對蝦腸道菌群豐富度（Chao指數）、多樣性（Shannon 指數）、均勻度（Simponeven指數）均無顯著性變化（P＞0.05）。但是108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗C組和1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗D組腸道菌群豐富度具有不同程度的提高，菊芋全粉與地衣芽孢桿菌表現出了一定的協同作用；1%菊芋全粉試驗B組和1%菊芋全粉+108cfu/g地衣芽孢桿菌試驗D組腸道菌群多樣性也有不同程度提高。

2.3.2 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦腸道微生物β多樣性的影響 基于Bray-Curtisdistance算法的主坐標分析（PCoA）表明，試驗對蝦腸道菌群結構按照處理狀況聚類，其中第一軸和第二軸共同解釋了73.53%的腸道微生物群落差異 （圖8）。試驗組與對照A組之間的分散程度存在顯著性差異，菊芋全粉與芽孢桿菌可以改變凡納濱對蝦腸道微生物的菌落聚集情況。非度量多維尺度分析（NMDS）也得出了相似的結論（圖9）。

2.3.3 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦腸道微生物種類的影響 通過物種注釋分析，評估各試驗組對蝦腸道微生物種類的相對豐度，對其進行比較分析，在門的水平上發現了4個主要菌群（圖10～11）。根據豐度的排名依次為變形菌門（74.28% ～ 88.08%，α-變形菌綱、γ-變形菌綱）、擬桿菌門（7.69%～21.57%，擬桿菌綱）、放線菌門（1.08% ～3.60%，放線菌綱）、厚壁菌門（0.06% ～3.11%，芽孢桿菌綱）。其中放線菌門在試驗組之間存在顯著性差異。

通過組間差異顯著性檢驗可知，在目水平上，弧菌目最多，然后是紅桿菌目、黃桿菌目以及交替單胞菌目（圖12）。其中，1%菊芋全粉試驗B組對蝦腸道弧菌目相對豐度比例顯著低于其他試驗組，并且其紅桿菌目、黃桿菌目和交替單胞菌目相對豐度顯著高于其他試驗組（P＜0.05）。這可能是因為菊芋全粉可以增加物種豐富度，調節腸道菌群平衡；但同樣添加了1%菊芋全粉的試驗D組卻沒有這種現象。

3 討論

3.1 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦生長性能的影響 有關益生元、益生菌對凡納濱對蝦生長性能影響的研究有很多。但是影響效果報導不一。例如，Li等（2018）研究表明，益生元可以提高對蝦生長速度；Boonmee等（2015）試驗得出，益生元、益生菌可以使對蝦高產的結論；Widagdo等（2012）試驗結果表明，益生元可以提高對蝦存活率。而Bolívar等（2013）試驗報道，益生元、益生菌對生長性能無影響；Li等（2007）也得出了益生元不能提高對蝦增重率，飼料轉化率和存活率的結論；Anuta等（2016）發現，益生元對增重率、存活率的影響不顯著。這可能與益生元的種類、使用方法或對蝦的品種、大小和飼養方式等有關。本研究結果表明，飼料中添加108cfu/g地衣芽孢桿菌可以顯著提高對蝦存活率；飼料中分別添加了1%菊芋全粉和108cfu/g地衣芽孢桿菌的兩個試驗組均可顯著提高對蝦的飼料利用率。和對照A組相比，試驗組最終體重和特殊生長率沒有顯著性差異。并且試驗中菊芋全粉與地衣芽孢桿菌沒有表現出協同作用。這與Li等（2009）的結果一致，具體機理需要進一步研究分析。

3.2 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦免疫力的影響 集約化的對蝦養殖，極易感染多種致病菌，使對蝦養殖業停滯不前。因為甲殼動物缺乏特異性免疫，所以在清除病原體的免疫過程中，非特異性免疫的作用至關重要（Mithieux，2018）。THC數量可以一定程度上體現機體的細胞免疫水平（陳效儒，2009；Jiang 等，2004）。 本研究中分別添加1%菊芋全粉和108cfu/g地衣芽孢桿菌可以適當增加THC數量，但沒有顯著性差異。二者的聯合使用卻可以顯著增加THC數量，這表明二者具有協同作用。盡管菊粉和地衣芽孢桿菌增加THC數量的機理尚不明確，但是試驗結果顯示，二者確實可以通過增加血細胞數量來提高對蝦的免疫反應。呼吸爆發（RB）是吞噬細胞清除病原體時的免疫機制，已廣泛作為評估非特異性免疫防御病原體的指標。本研究中1%菊芋全粉對RB沒有影響。108cfu/g地衣芽孢桿菌可以顯著提高對蝦RB；1%菊芋全粉與108cfu/g地衣芽孢桿菌聯合使用具有一定的協同作用，可以進一步提高RB，但沒有顯著性。這一結果與鄭玉等 （2017）和Zhang等（2011）的結論相似。凡納濱對蝦的代謝活動會產生大量活性氧損傷機體，所以對蝦的T-AOC活性與免疫健康息息相關 （Wu等，2014；張克烽等，2007）。LZM可以水解革蘭氏陽性菌細胞壁中的乙酰氨基多糖，因此可作為對蝦非特異性免疫功能的指標。本研究中1%菊芋全粉與108cfu/g地衣芽孢桿菌都能夠顯著性增強T-AOC和LZM活性，但是二者聯合使用沒有明顯的協同作用。這與張月（2017）、Zhang等（2011）的結果相似。 然而，菊芋全粉和地衣芽孢桿菌在凡納濱對蝦免疫性能上影響的機理還需要進一步的試驗闡明。

3.3 菊芋全粉與芽孢桿菌對凡納濱對蝦腸道微生物的影響 本研究使用Illumina Miseq高通量測序技術對凡納濱對蝦的腸道生物群落進行分析，發現變形菌門、擬桿菌門、放線菌門為對蝦腸道內的優勢菌群，這一發現與裴鵬兵等（2018）的結果吻合。其中變形菌中相對豐度最高的是弧菌目，包括80多種細菌，多為機會致病菌，而像霍亂弧菌、副溶血性弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌等都是對蝦養殖中的易感病原菌。本研究結果表明添加1%菊芋全粉可以顯著降低弧菌目的相對豐度，同時顯著促進紅桿菌目、黃桿菌目的生長，大幅度調節腸道菌群平衡，此結果與Yamazaki等（2016）的研究結果一致。而108cfu/g地衣芽孢桿菌組與對照組相比菌群豐度差異較小，可知單獨添加地衣芽孢桿菌無法有效調節對蝦的腸道，這可能與地衣芽孢桿菌無法在對蝦腸道中有效定植有關（Zhang等，2011）。同時添加了1%菊芋全粉與108cfu/g地衣芽孢桿菌的試驗組可以降低弧菌目的相對豐度，促進紅桿菌目生長，但是效果不顯著，二者之間的協同作用不明顯，可能與養殖時間過短有關系。另外，本研究還發現紅桿菌目的比例與對蝦特殊生長率成正相關，這與Jia等（2019）得出紅桿菌可以促進水產生物生長速度的結論一致，這可能是因為紅桿菌可以產生聚羥基丁酸酯，進而促進對蝦的生長。然而其作用機理尚無合理解釋，菊芋全粉與地衣芽孢桿菌影響腸道菌群的作用機制需要進一步的試驗解析。本研究結果顯示不同的試驗組間對凡納濱對蝦的腸道菌落豐富度、均勻度和多樣性盡管有一定影響，但是不顯著。在綱水平上添加了1%菊芋全粉的試驗組具有更多樣的生物群落。這與Dimitroglou等（2010）利用甘露寡糖可以增加金頭鯛腸道菌群豐富度和多樣性的結果相似。也有研究表示益生元會使鯛魚腸道菌群豐富度降低（Cerezuela等，2013）。實際上，益生元和益生菌的實際功效受多種因素影響，其來源、用量和使用方法的不同，應用對象的種類、年齡以及養殖條件的差異均可影響最終效果。然而，其作用機理復雜，需要進一步探討。

4 結論

108cfu/g地衣芽孢桿菌可以顯著提高對蝦的存活率和飼料利用率，同時可以提高T-AOC和LZM的活性；1%菊芋全粉和108cfu/g地衣芽孢桿菌聯合使用可以顯著提高THC與RB能力。另外，飼料添加劑對凡納濱對蝦腸道微生物的α多樣性有一定影響；與對照組相比，試驗組之間的菌落組成更為同源，這說明飼料添加劑可以顯著的改變腸道菌群物種豐度。綜上所述，菊芋全粉與地衣芽孢桿菌均可在不同程度上調節對蝦腸道菌群，在免疫活性的提高上具有一定的協同促進效果，因此它們具備作為對蝦免疫增強劑的潛在價值。