高效液相色譜法測定新型抗菌肽桿菌七肽的含量

張 江， 黃邦俊， 李學莉， 王 旭， 周曉容

（1.安杰利（重慶）生物科技有限公司，重慶榮昌 402460；2.捷力生科（重慶）生物科技有限公司，重慶榮昌 402460；3.重慶市畜牧科學院，重慶榮昌 402460）

桿菌七肽又名腺苷七肽（Microcin C7肽），是由乳桿菌、腸桿菌屬的細菌產生的一類小分子量的細菌素類抗菌肽，其由7個氨基酸殘基組成，N端天冬氨酸的羧基與單磷酸腺苷（AMP）通過N-酰基氨基磷酸酯鍵共價連接組成的核酸肽。不同微生物分泌的桿菌七肽其氨基酸序列有所差別，但其第一個氨基酸蛋氨酸和第七個氨基酸天冬氨酸為其保守序列（Olga 等，2014；Severinov，2012）。桿菌七肽主要抑菌機理為干擾微生物翻譯蛋白來實現抑菌作用 （冉仁森，2017；Metlitskaya等,2006）。桿菌七肽對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門氏菌以及某些革蘭氏陽性菌均具有很強的殺滅和抑制作用，是潛在的抗生素替代品 （冉仁森，2017）。桿菌七肽可采用化學合成法和微生物發酵法生產。而建立桿菌七肽定量檢測方法對于其生產和品控具有重要意義，可以使相關企業進行質量控制，監測產品在生產和使用過程中的穩定性。許多研究表明，細菌素類抗菌肽如NISIN可以采用反向高效液相色譜法測定，具有快速、簡單和重復率高的優點（高彩紅等，2011），鑒于桿菌七肽含量的測定鮮有報道，本研究目的就是建立一種應用高效液相色譜（HPLC）來快速定量測定桿菌七肽的方法。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 樣品：桿菌七肽純品 （純度99.5%），制備方法參考 Yu等（2017）方法，由國家飼料工程技術研究中心西南分中心提供；桿菌七肽噴霧干燥粉，由安杰利（重慶）生物科技有限公司提供，載體為可溶性淀粉，工藝為約氏乳桿菌發酵、離心、濃縮加入麥芽糊精后進行噴霧干燥獲得。

儀器：高效液相色譜儀 （賽默飛Ulti-Mate3000）、C18（4.6 mm×150 mm）反相色譜柱、電子天平（BT2202S）、超純水儀（Milli-Q）、臺式離心機、溶劑過濾器、漩渦混合器（VORTEX 2）、0.22 μm水相濾膜和有機相濾膜、離心管（2、10 mL）、試管等。

試劑：三氟乙酸TFA（色譜級）、乙腈（色譜級）、超純水（Milli-Q）。 流動相A（0.1%TFA ）的配制：量取 1000 mL超純水，加入 1 mL TFA，用 0.22 μm濾膜過濾，超聲脫氣10 min；流動相B（80%乙腈）：量取 800 mL乙腈，加超純水200 mL，用 0.22 μm有機濾膜過濾，超聲脫氣10 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品（標準品）制備 稱取450 mg桿菌七肽純品，定容于100 mL，超聲波振蕩15 min，使其全部溶解，則抗菌肽濃度為4.5 mg/mL。

1.2.2 樣品前處理 準確稱量1.00 g樣品于25 mL容量瓶中，加入純水，用超聲處理15 min后定容至25 mL，再次顛倒混勻后取出6 mL于三個2 mL離心管內，8000 r/min離心2 min后用0.22 μm濾膜過濾，將前約1 mL溶液棄去，后面的溶液接樣檢測。

1.2.3 高效液相的檢測 依次開啟電腦和高效液相色譜儀各模塊電源，然后打開高效液相色譜儀化學工作站。逆時針旋開液相色譜儀放空閥打開旁路，用0.22 μm過濾的超純水沖洗管路，流速為5 mL/min時，再用流動相A、B充滿管路。接上連接有保護柱的反相色譜柱，參數設為：柱溫：25℃（室溫），檢測波長：280 nm（214 nm 為參考波長），最大壓力：300 bar，流速：1 mL/min，樣品分析洗脫梯度如表1所示。系統平衡至基線水平，檢測系統適應性：取抗菌肽標準品適量，加水溶解并稀釋成1 mL含抗菌肽0.5 mg的溶液，作為系統適用性溶液，進樣量10 μL，連續進樣3次測定，峰面積RSD≤2%，表明系統能滿足檢測要求。

表1 樣品洗脫梯度

1.2.4 標準曲線的繪制 將抗菌肽溶液 （濃度為4.500 mg/mL）按照2倍稀釋，分別得到2.250、1.125、0.563、0.281 mg/mL的溶液，以雙蒸水為對照，每個濃度檢測3次，通過液相獲得峰面積（峰面積單位用mAU*min表示）。

1.2.5 加標回收率實驗 對照品和不影響其檢測的可溶性載體（元明粉），制成2%、1%和0.50%桿菌七肽含量的樣品，進行3次檢測，計算回收率。

1.2.6 穩定性實驗 將供試品溶液至于室溫條件下，分別于 0、4、8、16、24 h 取 10 μL 注入液相色譜儀，測定峰面積，記錄抗菌肽峰面積值，計算相對標準偏差（RSD）。

1.2.7 精密度實驗 精密吸取對照品溶液10 μL注入液相色譜儀，測定峰面積，于同日內重復測定 6次，計算日內精密度;連續測定 5 d，計算日內相對標準偏差（RSD）。

1.3 統計分析 數據采用Excel進行計算平均值、標準偏差、相對標準偏差和回歸曲線。

2 結果與分析

2.1 專屬性實驗 在1.2.3的色譜條件下，桿菌七肽對照品（標準品）的保留時間為13.9 min（圖1），其桿菌七肽樣品（噴霧干燥粉末）在保留時間13.9 min處有明顯的峰（圖2），桿菌七肽與相鄰的峰分離度為2.2（大于1.5），而陰性對照（水）對應保留時間無峰面積。

2.2 回歸曲線的繪制 以高效液相色譜獲得的峰面積為縱坐標（Y），上樣濃度（mg/mL）為橫坐標（X）， 得出回歸曲線為 Y=10.353X+0.3806，R2=0.9997（n=6），抗菌肽濃度為 0 ～ 4.5 mg/mL 時與峰面積的線性關系良好（圖3）。每個濃度梯度上樣三次，RSD均小于2%（表2）。

表2 桿菌七肽濃度和相應的峰面積

2.3 加標回收率實驗 表3結果顯示，抗菌肽含量為0.25%～2.00%時，其回收率為96.0%～108.0%，表明其回收率較好，誤差較小。

表3 回收率實驗

2.4 穩定性實驗 由表4可知， 經過0、4、8、16、24 h測定桿菌七肽的含量，峰面積和含量RSD均小于2%，表明其在24 h內穩定性較好。

表4 穩定性實驗結果

3 討論

采用反向高效液相色譜法可快速測定桿菌七肽的含量，其方法簡單、重復性較好，徐和等（2013）采用C18色譜柱，流動相為甲醇-乙腈-0.05%TFA溶液，建立了高效液相色譜法測定小菜蛾中抗菌肽CA抗菌肽含量的方法；高彩紅等（2011）采用采用C18色譜柱，流動相為10%乙腈-90%乙腈，建立了高效液相色譜法測定乳鏈球菌素含量（效價）的方法；這些方法簡單、準確性高。借鑒之前已發表的研究結果，本研究采用C18色譜柱，以80%乙腈 -0.1%TFA為流動相，測定桿菌七肽的含量，實驗結果發現其分離度較好，不受雜峰的影響，可以清晰的辨別目的峰，說明此色譜條件是合適的。本實驗通過繪制標準曲線，桿菌七肽濃度為0～4.5 mg/mL時線性關系較好 （R2=0.9997），RSD＜2%。通過加標回收率實驗，其回收率為96%～108%，驗證了標準曲線是正確的，可以用作桿菌七肽含量檢測。通過穩定性實驗，發現室溫下桿菌七肽在24 h內穩定性較好。 桿菌七肽高效液相測定方法的建立，對于生產過程中的質量控制（QC）和質量保證（QA）提供了科研依據，同時，為進一步研究桿菌七肽在體內動力學的測定提供了參考方法。

4 結論

本實驗建立的高效液相法簡單、準確、重復性好，可用于桿菌七肽含量的測定。