快速水蒸氣蒸餾-流動注射分析儀聯用測定飼料中氰化物

馬 興， 宋 旭， 肖亞兵

（天津海關動植物與食品檢測中心，天津300461）

飼料中氰化物主要來源于植物源性飼草、飼料本身所含有的氰甙類物質，目前已知的氰甙類物質達21種（雷祖玉等，1992），種類雖少，但廣泛分布于各類植物中。幾乎所有的植物中都會含有痕量氰，部分植物中含量甚至高達500 mg/kg。常用作飼草、飼料或飼料原料的木薯 （Banea等，2012）、燕麥幼苗、玉米幼苗、高粱幼苗、海南刀豆（李瓊芳等，2006）和亞麻籽（張建華等，1998）等含氰量都比較高。當氰甙進入動物體內后，在酸和酶的作用下會釋放出游離氰化物，由于氰離子具有很強的金屬配位能力，能夠抑制細胞內多種含金屬離子的酶系統，致使細胞色素氧化酶、乳酸脫氫酶和過氧化氫酶等失活，從而導致中毒現象（Kumar等，2019；Kumar等，2018； 翟雙雙等，2014）。輕度氰化物中毒表現為精神萎靡、食欲不佳、體弱消瘦，嚴重者多由于窒息、肌肉痙攣導致死亡。

目前，測定飼料中氰化物含量的國家標準GB/T 13084-2006規定了氫氰酸與苦味酸鈉的定性顯色方法和分光光度的定量檢測方法。其中定量檢測方法操作要點是樣品粉碎浸泡后用水蒸氣蒸餾的方法將氫氰酸蒸出，用氫氧化鈉溶液吸收，然后與異煙酸-吡唑啉酮反應顯色，分光光度計測定。但是傳統水蒸氣蒸餾時間長，操作復雜，重現性較差，后續分光光度法步驟也較為繁瑣，不可控因素較多，需耗費大量人力。這些缺點也導致該方法檢測效率較低，易出現偶然誤差，對檢測人員的操作技能和檢測經驗要求較高。

流動注射分析儀目前主要應用于水質氰化物、揮發酚等的檢測。與傳統分光光度法相比，流動注射分析法具有自動化高、進樣量小、試劑消耗量小、環保性高、檢測量大、穩定性強等優點。目前飼料樣品中氰化物含量的測定主要還是應用分光光度法（高月等，2016；周小潔等，2008），流動注射法鮮有報道。近年來，流動注射法在食品、海水和白酒等復雜基體中硫酸鹽 （Ruiz-Capillas等,2009）、痕量錳（Feng 等，2018）、氰化物（閔巍等，2018）等項目的檢測中均取得了較好的結果。

本文使用課題組自主設計并制備的快速水蒸氣蒸餾儀提取飼料中氰化物，再用流動注射儀檢測，將檢測流程由原先的5～7 h縮短至30 min以內，節省了人力物力，提高了檢測效率，方法檢出限、準確度和精密度均滿足實際要求。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑

1.1.1 儀器 連續流動注射儀：德國Seal公司Seal Auto Analyzer 3型；自動進樣器：德國Seal公司XY-2型；超純水系統：美國密理博公司Milli-Q型；分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司ME203型，感量0.001 g；快速水蒸氣蒸餾儀：自主研發。

1.1.2 試劑 氫氧化鈉、鹽酸、乙酸、異煙酸、檸檬酸、硫酸鋅、酚酞、二甲基巴比妥酸、鄰苯二甲酸氫鉀、酒石酸、乙酸鋅、吡唑酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯胺T：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。水中氰成分分析標準物質GBW（E）080115：50.0 μg/mL，中國計量科學研究院。 氰化物標準中間液：1.0 μg/mL，吸取1 mL標準物質，用2 g/L氫氧化鈉溶液定容至50 mL。流動注射儀所需試劑按照Seal公司自帶方法配制；分光光度法所需試劑按照GB/T 13084-2006要求配制。

1.2 流動注射儀工作條件 進樣速率30個/h；進樣清洗比（時間）3：1；蒸餾溫度 135 ℃。

1.3 實驗步驟

1.3.1 樣品前處理 將飼料樣品粉碎或勻漿，迅速稱取10 g（精確到0.001 g）待測樣品置于500 mL反應瓶中，加入200 mL去離子水，迅速安裝至快速水蒸氣蒸餾儀中，并將冷凝管下端插入盛有5 mL濃度為10 g/mL氫氧化鈉溶液的三角瓶中，室溫放置10 min。向反應瓶中加入20 mL濃度為100 g/L的乙酸鋅溶液和1～2 g酒石酸后，迅速將反應瓶安裝于快速水蒸氣蒸餾儀中，設定接收液質量達到90 g為蒸餾終點，并啟動加熱程序。蒸餾結束后，將接收液轉移至100 mL容量瓶，并定容。

1.3.2 標準工作曲線配制 分別吸取 0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 mL 氰化物標準中間液于10 mL具塞比色管，用2 g/mL氫氧化鈉溶液定容，所配制的氰化物標準工作溶液的質量濃度分別為 0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.250、0.500 μg/mL。分別取標準系列溶液5 mL，用流動注射儀進行測定，以標準系列溶液為橫坐標，以峰高為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結果與討論

2.1 實驗條件的選擇及優化

2.1.1 快速水蒸氣蒸餾前樣品浸泡時間的選擇飼料樣品中氰化物并不穩定，粉碎或勻漿后需要及時提取。采用快速水蒸氣蒸餾前，樣品需室溫中浸泡一段時間使氰甙水解。實驗過程中，選取飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯作為目標樣品，考察了浸泡時間對檢測結果的影響。如表1所示，對于三種不同類型飼料，浸泡時間分別為 10、30 min，1、2 h，所得檢測結果均在 10%誤差范圍內，并無顯著性差別，為提高實驗效率，故選擇浸泡時間為10 min。

2.1.2 水蒸氣蒸餾速度的選擇 快速水蒸氣蒸餾儀可根據實際需求選擇蒸氣量，蒸氣量的大小直接決定蒸餾時間的長短。試驗過程中，選取飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯作為目標樣品，在浸泡時間均為10 min的條件下，分別選擇高、中、低三種不同大小蒸氣量對待測樣品進行氰化物提取，所得結果無顯著性差異，故選擇較高蒸氣量開展后續實驗，樣品提取時間約8～10 min，具體結果見表2。

表1 不同浸泡時間下提取氰化物檢測結果mg/kg

2.2 線性方程及方法檢出限 用連續流動注射儀對1.3.2中所述氰化物標準工作溶液進行測定，以標準工作液濃度為橫坐標（X，μg/mL），以峰高為縱坐標 （Y）進行線性擬合，得線性方程Y=498609X+6443.7，線性相關系數為0.9997。對空白溶液進行6次重復測定，以測定值3倍標準偏差計算方法檢出限，得方法檢出限為0.0023 mg/L。當稱樣量為10 g，定容體積為100 mL時，待測樣品中氰化物的檢測限為0.023 mg/kg（以氰離子計）。

表2 不同蒸氣量下提取氰化物檢測結果mg/kg

2.3 精密度測試 以飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯作為目標樣品，每個樣品按照前述方法全流程重復測定6次，計算結果的精密度，結果見表3。由表3可見，3個樣品檢測結果相對標準偏差為3.5%～4.9%，表明本方法精密度較好。

2.4 加標回收測試 以飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯為本底，分別加入高、中、低三種不同濃度的氰化物標準中間液，每個樣品按照前述方法全流程重復測定6次，計算每個樣品的平均加標回收率，結果見表4。由表4數據可以看出，三個不同濃度的樣品平均加標回收率為96.5%～104%，表明本方法具有較高的準確度。

表3 精密度實驗結果

2.5 本方法與國標方法結果比對 用國家標準GB/T 13084-2006檢測方法分別對飼料用木薯粉、含木薯成分豬飼料和玉米苗青貯進行檢測，所得結果與本文方法進行比對，并計算相對偏差，結果見表5。從表5可以看出，兩種方法測定結果的偏差為3.7%～6.3%，符合GB/T 13084-2006的規定。

表4 加標回收實驗結果

3 結論

本文建立了快速水蒸氣蒸餾-流動注射分析儀聯用測定飼料中氰化物含量的檢測方法。快速水蒸氣蒸餾儀的使用，能夠有效提高前處理效率；流動注射分析儀的使用，簡化了檢測中的人工操作，提高了檢測結果的穩定性。數據結果表明，本方法檢出限、定量限、精密度和準確度均能夠滿足實際檢測需求；采用本方法和國標方法測定三種不同飼料樣品中氰化物的含量，所得結果數據無顯著性差異。本方法與國標方法相比，全流程檢測時間僅為國標方法的1/10，同時具有準確度高、穩定性好的特點，在分析大批量飼料樣品時具有較大優勢。

表5 與國標方法比對