補喂亮氨酸對伊犁馬血漿氨基酸及其主要相關代謝物濃度的影響

艾畢肯， 賴曉鶴， 張文杰， 韓 明， 劉 律，張仕琦， 鄭文祥， 歐陽文， 祁居中， 楊開倫*

（1.新疆農業大學動物科學學院，新疆肉乳用草食動物營養重點實驗室，新疆烏魯木齊 830052；2.新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣種馬場，新疆昭蘇 835000）

亮氨酸（Leu），又稱為白氨酸，是必需氨基酸之一，動物機體自身不能合成，只能在日糧中獲取（Lee等，2019）。Leu在肌肉中在支鏈氨基酸氨基轉移酶的催化下能發生可逆反應，生成α-酮異己酸（KIC），然后進入肝臟，在肝臟細胞溶膠中被KIC二氧化酶催化生成β-羥基-β-甲基丁酸（HMB）（Arazi等，2018）。 Van 和 Nissen（1992）研究表明，Leu的代謝產物KIC和HMB同Leu一樣具有調控蛋白質代謝的作用，抑制蛋白質降解主要通過KIC刺激胰島素的分泌以及HMB抑制泛素-蛋白酶體系統來進行。

研究表明，食物缺乏的大鼠口服Leu可以刺激其骨骼肌蛋白質的合成，這不依賴于循環中胰島素的濃度，而是通過促進eIF4F的形成來進行的（Anthony 等，2000）；Boutry 等（2013）的研究結果表明，給新生豬腸外輸注Leu能增加肌肉蛋白質的合成；Suryawan 等（2012）為新生豬以 148 μmol/kg的輸注率從頸靜脈滴注Leu 10 min，然后再以400 μmol/kg·h持續滴注1 h，結果表明Leu通過誘導mTORC 1及其下游通路的激活來促進新生豬mRNA的翻譯，使肌肉蛋白質合成；Bro·jer等（2012）給馬匹服用葡萄糖和Leu時，馬匹運動后6 h內的血漿胰島素濃度明顯高于給馬匹注射生理鹽水時的血漿胰島素濃度，但是，對馬匹體內糖原合成速率沒有影響；而在人類補充Leu的研究中，獨木舟運動員通過6周的飲食補充Leu，顯著提高了上半身力量和耐力（Crowe等，2006）。本試驗選擇年齡為1歲的伊犁馬為研究對象，探究通過在日糧添加不同水平的Leu對伊犁馬血漿氨基酸濃度以及Leu及其代謝產物KIC、HMB吸收規律的影響，為Leu在伊犁馬飼養中的應用及Leu需要量的確定提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點 本試驗于2019年9月18日至2019年10月8日在新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣種馬場進行。

1.2 試驗設計及飼糧組成 試驗采用單因素多水平試驗設計方法。挑選體重為（321.68±25.7）kg、年齡為1歲的伊犁馬20匹，分為四組，設為對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組，每組5匹（3♀+2♂），試驗馬匹日糧組成及營養水平見表1，精料補充料及干牧草中氨基酸含量見表2。粗飼料每匹（7.00±0.80）kg/d，精料補充料 3 kg/d。 在此基礎上，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別補喂 17、34、51 g Leu（Leu購自烏魯木齊市新華銳飼料有限公司，純度98%，含量≥90%）。玉米和次粉以1：1的比例混合均勻，再與Leu以1：1的比例制作成顆粒的形式與精料補充料混合飼喂。所有試驗馬匹均在單獨的馬廄飼養，自由飲水。試驗期21 d。每天定時打掃馬廄，更換干凈的墊料。

1.3 樣品的采集及指標測定

1.3.1 樣品的采集 在試驗的第21天進行樣品的采集。分別在飼喂前，飼喂后1、2、4 h用5 mL肝素鈉抗凝管于試驗馬匹進行頸靜脈采血。3500 r/min離心10 min，收集上清血漿，分裝于2 mL凍存管中，-20℃冷凍保存。

1.3.2 指標測定 飼喂后2 h的血漿樣品指標：20種氨基酸、3-甲基組氨酸（3-MH）；飼喂前、飼喂后 1、2、4 h 血漿樣品指標：KIC、HMB。 以上樣品均送至天津普瑞華盛醫學檢驗有限公司測定。均采用高效液相色譜串聯質譜聯用法測定。

1.4 數據處理 試驗數據采用Excel 2010進行初步整理，再用SPSS 22.0軟件中單因素方差分析（one-way ANOVA）數據的差異顯著性，同時使用Duncan’s法進行多重比較。試驗結果以“平均值±標準誤”表示。采用正交多項式對比，檢驗日糧中Leu濃度增加的線性和二次效應。以P＜0.05表示差異顯著水平，P＜0.01表示差異極顯著水平。

表1 精料補充料及干牧草的營養水平（干物質基礎） %

表2 精料補充料及干牧草中氨基酸含量（干物質基礎）%

2 結果與分析

2.1 補喂Leu對伊犁馬血漿支鏈氨基酸濃度的影響 由圖1可知，血漿中Leu濃度隨著Leu補喂水平的增加而呈上升的趨勢 （擬合方程為y=4.128x+102.84，R2=0.9492）。各試驗組伊犁馬血漿Leu濃度均高于對照組。

圖1 日糧亮氨酸補喂水平與伊犁馬血漿亮氨酸濃度的關系

由表3可知，與對照組相比，試驗Ⅲ組血漿亮氨酸濃度顯著升高90.53%（P＜0.05）；試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組血漿異亮氨酸濃度分別降 低 32.18% （P ＜ 0.05）、50.53% （P ＜ 0.01）、39.27%（P＜0.05）；試驗Ⅱ組血漿纈氨酸濃度有下降趨勢（P=0.044）。

表3 補喂亮氨酸對伊犁馬血漿支鏈氨基酸濃度的影響 μmol/L

2.2 補喂Leu對伊犁馬血漿KIC、HMB濃度的影響

2.2.1 補喂Leu對伊犁馬血漿KIC濃度的影響由圖2可知，血漿KIC隨著Leu補喂水平的增加而呈上升的趨勢。不補喂Leu時，血漿KIC濃度最低，Leu補喂水平為每匹馬每頓8.5～17 g時血漿KIC濃度趨于平緩，超過17 g時，血漿KIC濃度有持續升高的趨勢。

圖2 日糧亮氨酸補喂水平與伊犁馬血漿中α-酮異己酸濃度的關系

由表4可知，在飼喂前，與對照組相比，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組血漿KIC濃度差異不顯著 （P＞0.05），試驗Ⅲ組血漿KIC濃度顯著升高 （P＜0.05），升高了30.56%。與試驗Ⅱ組相比，試驗Ⅲ組血漿KIC濃度顯著升高 （P＜0.05），升高了35.52%。飼喂后1 h各組血漿KIC濃度差異不顯著（P＞0.05）。在飼喂后2 h，試驗Ⅲ組血漿KIC濃度比對照組顯著升高 （P＜0.05），升高了43.54%。在飼喂后4 h，與對照組相比，試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組血漿KIC濃度差異不顯著 （P＞0.05），試驗Ⅲ組血漿KIC濃度極顯著升高 （P＜0.01），升高了53.91%。

表4 補喂亮氨酸對伊犁馬血漿α-酮異己酸濃度的影響μmol/L

2.2.2 補喂Leu對伊犁馬血漿HMB濃度的影響由圖3可知，不補喂Leu時伊犁馬血漿HMB濃度最高，其隨著Leu補喂水平的增加而呈下降的趨勢，當每匹馬每頓Leu補喂水平＞17 g時，血漿HMB濃度趨于平緩。

圖3 日糧亮氨酸補喂水平與伊犁馬血漿中β-羥基-β-甲基丁酸濃度的關系

由表5可知，補喂Leu對伊犁馬血漿HMB濃度無顯著影響（P＞0.05）。對照組、試驗Ⅰ組血漿HMB濃度在飼喂后1 h達到峰值，試驗Ⅱ組、試驗Ⅲ組血漿HMB濃度在飼喂后4 h達到峰值。

表5 補喂亮氨酸對伊犁馬血漿β-羥基-β-甲基丁酸濃度的影響 μmol/L

2.3 補喂Leu對血漿中非支鏈氨基酸、3-甲基組氨酸濃度的影響 由表6可知，與對照組相比，試驗Ⅰ組血漿Glu濃度極顯著降低37.07%（P＜0.01），試驗Ⅲ組顯著降低 26.52%（P ＜ 0.05）。

與對照組相比，試驗Ⅲ組血漿3-MH濃度有下降趨勢（P=0.055），血漿半胱氨酸濃度有下降的趨勢（P=0.060）。與試驗Ⅰ組相比，試驗Ⅲ組血漿3-MH濃度有下降趨勢（P=0.051）。

表6 補喂亮氨酸對伊犁馬血漿非支鏈氨基酸濃度的影響 μmol/L

3 討論

3.1 補喂Leu對伊犁馬血漿氨基酸濃度的影響BCAA能促進腸道發育，促進腸道氨基酸運輸和黏液蛋白的產生，調節免疫反應，刺激骨骼肌蛋白合成，研究表明，BCAA中最有效的是Leu（Escobar等，2010）。Leu具有刺激骨骼肌中蛋白質合成和抑制蛋白質降解的能力，這種促進蛋白質合成主要通過上調雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1）的活性，而抑制降解主要在組織中通過泛素-蛋白酶體途徑發生 （Norton和Layman，2006）。

本試驗中，補喂Leu顯著提高了伊犁馬血漿Leu濃度，極顯著降低血漿Ile濃度，血漿Val濃度有下降的趨勢，對BCAA濃度無顯著影響。孫玉麗（2015）為7日齡的正常新生哺乳仔豬及宮內生長受限新生哺乳仔豬連續灌服14 d的Leu，研究結果表明，與對照組相比，給正常新生仔豬補喂Leu極顯著提高了血漿中Leu濃度，極顯著降低了血漿中Val和Ile的濃度，為宮內生長受限新生哺乳仔豬補喂Leu極顯著升高了血漿中Leu濃度，血漿中Val及Ile濃度隨著補喂的Leu水平升高有下降的趨勢；Wiltafsky等（2010）為去勢豬補喂Leu 34 d，共6個處理組，L100組Leu水平為11.5 g 標準化回腸可消化 Leu/kg，L150、L175、L200組的Leu水平為 L100組的 150%、175%、200%，在大于200%的組中，Leu水平為L100組的一倍，該研究的陽性對照組日糧組成與L100組相同，但Ile水平為6.3 g標準化回腸可消化Ile/kg，研究結果表明補喂Leu增加一倍的組，血漿Leu增加64%，這與本研究結果一致。這是因為Leu與其他BCAA競爭抑制。BCAA家族及Trp是由中性氨基酸轉移載體 （LAT）家族中的一員LAT1轉運的，這是因為含有支鏈和苯環側鏈大分子的BCAA與其親和力較強 （Neinast等，2019）。Leu競爭性的結合LAT1，抑制了Ile及Val在血漿 中 的 量 （Wolfe 和 Robert，2017；Louard 等 ，1990）。Leu血漿濃度的升高激活了所有BCAA的氧化代謝途徑，結果導致血漿中Ile和Val降低，當單獨使用Leu時，Ile和Val的可用性可能會限制肌肉蛋白質合成的速度（董千銅等，2014）。Zeitz等（2019）將450只成年雄性肉雞平均分為三個試驗組，對照組飼喂超過推薦劑量15%的Leu，L35組飼喂超過推薦劑量35%的Leu，L60組飼喂超過推薦水平60%的Leu，進行為期5周的試驗，結果顯示L60組的Leu既不會影響肉雞蛋白質合成和降解的分子途徑，也不會影響5周內的生產性能。隨著Leu攝入量增加到所需水平，Ile和Val的濃度下降，可能是由于這些氨基酸現在正以越來越多的量用于蛋白質合成。然而，Val、Leu、Ile的比例幾乎總是接近于1.6：2.2：1.0（Louard等，1990），這也可能是在本研究中Ile濃度低的原因。

本試驗中，試驗Ⅰ組血漿谷氨酸的濃度極顯著低于對照組，試驗Ⅲ組顯著低于對照組。當動物體內氨基酸降解速度過高，體內產生一些過量且必須排出的氨時，氨基酸降解速度增高的信號會使轉氨反應加速，從而會引起谷氨酸濃度的增高（Schachter和 David，2008）。 而本試驗中血漿谷氨酸濃度降低，可能是由于馬匹血漿氨基酸降解的速度下降引起氨的量降低，導致谷氨酸濃度降低。

在谷氨酰胺合成酶的催化下，谷氨酸轉化成谷氨酰胺，動物體內產生的過多氨與谷氨酸結合，生成谷氨酰胺（Erich，2008），而本試驗中血漿谷氨酰胺的濃度差異不顯著，可能是由于該反應是可逆的，處于動態平衡中。

3-MH可用于識別蛋白質的代謝。3-MH濃度的輸出用作肌肉蛋白質降解程度的指標，3-MH在肌肉降解期間釋放到循環中，然后在尿中定量、不可逆地排出而不被代謝（David和Pearlstone，1996）。肌動蛋白和肌球蛋白分解過程中的組氨酸甲基化是3-MH的唯一來源（Nagasawa和Takashi，1996）。馬匹是草食動物，體內的3-MH來源于飼糧中攝入的蛋白質，而蛋白質攝入對肌肉代謝的影響，導致3-MH不同程度的釋放到血液中（Kochlik等，2018）。也有研究表明，馬匹血漿中的3-MH濃度會受到季節的影響，主要是熱應激引起的，在7～9月馬匹血漿中3-MH的濃度顯著增加，在此之后降低（Glade等，1990）。本試驗中試驗Ⅲ組3-MH濃度有下降的趨勢，隨著Leu補喂水平的升高，3-MH的排出下降，這可能是補喂Leu有抑制蛋白質降解的作用，還需要進一步研究。

3.2 補喂Leu對伊犁馬血漿KIC、HMB濃度的影響 Leu促進蛋白質合成的作用，可能是通過其代謝產物KIC和HMB的作用產生的（Wilkinson等，2013），然而，支持這種觀點的證據鮮有報道。KIC作為Leu的直接代謝產物，且在分解代謝過程中刺激蛋白質合成的能力已被研究了60多年（Kang 等，1986），研究表明，KIC 能夠在不增加細胞內Leu濃度的情況下促進大鼠心肌中蛋白質合成并抑制蛋白質降解（Tischler等，1982）。HMB不僅能夠提高肌肉功能，而且能夠提高脂肪代謝速率并降低蛋白質分解速率，促進組織細胞修復，減輕肌肉損傷并延緩肌肉疲勞（He等，2016；Korna-sio 等，2009）。

本試驗中，血漿KIC的濃度隨著Leu的補喂水平呈升高趨勢，在飼喂前，與對照組相比，試驗Ⅲ組血漿KIC濃度顯著升高。飼喂后1 h各組血漿KIC濃度差異不顯著，各組都達到峰值，在飼喂后2 h各組血漿KIC濃度開始下降，與對照組相比，試驗Ⅲ組血漿KIC濃度顯著升高，飼喂后4 h，試驗Ⅲ組血漿KIC濃度極顯著升高；Wiltafsky等（2010）研究表明，為豬補喂不同水平的Leu，比Leu水平為11.5 g標準化回腸可消化Leu/kg多一倍的Leu組，在試驗第34天試驗動物禁食2.5 h后血漿中的KIC濃度增加了45%。這與本研究結果一致。在本試驗中，在飼喂后2 h，與對照組相比，試驗Ⅲ組血漿中KIC濃度升高43.54%，在飼喂后4 h血漿中KIC的濃度升高了53.91%，這說明補喂Leu伊犁馬血漿中的KIC濃度呈劑量依賴性增加。補喂Leu對伊犁馬血漿HMB濃度差異不顯著。飼糧中攝入的Leu可以繞過肝臟，使補喂后血漿Leu水平急劇升高，并在周圍組織中激活Leu信號傳導，隨后Leu在肌肉中被支鏈氨基酸氨基轉移酶的催化下發生可逆反應，生成KIC，然后KIC可以重新合成為Leu或被進一步氧化（Duan 等 ，2016；Shimomura 等 ，2001）。 大 多 數KIC氧化發生在肝臟中肝線粒體內，約90%的KIC被氧化為乙酰輔酶A的類似物異戊酰CoA，剩余5%～10%的KIC在肝臟細胞溶膠中被氧化為HMB，其中10%～40%隨尿液排出，其余的轉化為膽固醇和乙酰輔酶A（Arazi等，2018）。隨后，僅由Leu產生的HMB被腎臟清除或代謝為β-羥基 -β - 甲 基 戊 二 酰 -CoA （Girón 等 ，2016）。Wilkinson等 （2013） 研究表明， 向年齡為 （21±0.3），體重相近的7名健康男性青年受試者提供含有3.42 g Leu的400 mL水，采集2.5 h內的血液樣品，結果表明血漿中的HMB濃度一直保持不變，直到 150 min 后，HMB 濃度才從（3.2±0.6）μ mol適度上升到（10.3±3.5）μmol。 而在本研究中，補喂Leu對伊犁馬血漿HMB濃度無顯著影響，這可能是由于物種的不同和補喂Leu水平的不同引起的Leu代謝差異，也有可能是不同物種機體內Leu代謝途徑中相關酶的活性表達不同。

KIC的半衰期極短，血液中KIC的代謝很快（Harper和 Benjamin，1984）， 可能是因為 KIC 的氧化速率很快，這就解釋了各組血漿中KIC的濃度在飼喂后1 h達到峰值，然后下降的原因。但隨著時間的延長，試驗Ⅲ組血漿KIC的濃度趨于平緩，可能是由于補喂的Leu水平足夠，在KIC氧化的同時，Leu也在不斷地轉化為KIC（Moghei等，2016）。在Leu代謝的路徑中由于只有極少的Leu才能轉化為HMB，所以機體的HMB濃度也極少（Silva等，2017），這可能是本研究中補喂Leu對伊犁馬血漿HMB濃度的影響不顯著的原因。

4 結論

在本試驗條件下，補喂亮氨酸能提高伊犁馬血漿中亮氨酸的濃度，且隨著補喂水平的增加而升高；補喂亮氨酸降低了血漿異亮氨酸濃度，血漿3-甲基組氨酸濃度有下降的趨勢。補喂亮氨酸能提高伊犁馬血漿中α-酮異己酸濃度，但對血漿β-羥基-β-甲基丁酸的濃度無顯著影響。