核酸檢測：神奇的病毒捕手

陳錚

人人參予 攝影 路保林

自從此次新冠疫情開始，我們經常能聽到一個詞語：核酸檢測。

咽拭子輕輕一刮，就能檢出是否感染了新冠病毒。核酸檢測到底是如何做到讓看不見的病毒無處遁形的？這么牛的技術又是如何被發明和應用到病毒檢測這個領域的？

從基因層面查尋蛛絲馬跡

根據國家衛健委和國家中醫藥管理局聯合下發的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》，“釆用RT-PCR或/和NGS方法在鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、糞便等標本中可檢測出新型冠狀病毒核酸”，是確診新冠病毒感染最重要的病原學檢查依據。也就是說，核酸檢測，可以確定咽拭子、痰液等標本中到底有沒有新冠病毒。

說起核酸，它其實是所有生命體必不可少的一種組成物質，主要的職責就是攜帶生命體的遺傳信息。核酸主要分為兩種：脫氧核糖核酸（大家可能更熟悉它DNA這個名字）以及核糖核酸（RNA）。

DNA和RNA都是由一系列“核糖核苷酸”組成的鏈條，DNA是由兩條鏈組成的雙螺旋結構，而RNA則只有一條鏈。鏈條上不同種類核糖核苷酸的排列順序，就是遺傳信息。

在新冠病毒這樣的病毒生物中，攜帶遺傳信息的物質是RNA，每種病毒的RNA，都有其獨特的分子排列特征，就像病毒的指紋。所謂病毒核酸檢測，也就是使用特有技術，尋找病毒特有的RNA，能找到，我們就可以確定病毒的存在了。

尋找病毒RNA的方法有兩種，就是上面提到的RT-PCR（反轉錄基因擴增）和NGS（基因組測序）。

RT-PCR出結果快（約3-6小時出結果），NGS測序比較慢（約24-72小時出結果），所以大多數人核酸檢測采用的是RT-PCR這種方法。

用熒光標記快速定位病毒的RT-PCR技術

假設我們的咽拭子、鼻拭子、痰液等樣本中含有新冠病毒，RT-PCR檢測基本上是這樣一個過程：

第一步，從標本中提取新冠病毒的RNA。簡單來說，就是向咽拭子、鼻拭子、痰液等標本中加核酸提取試劑，這些提取劑會把病毒的外殼破壞掉，新冠病毒內的RNA核酸釋放出來。

圖片 大琦

第二步，是把新冠病毒RNA“反轉錄”成DNA。簡單來說，就是使用“反轉錄酶”，和核糖核苷酸“原料”，把新冠病毒的單鏈RNA“配對”上另一條由“原料”組成的相呼應的單鏈，組成一種特殊的雙鏈DNA——cDNA，暫且管它叫“新冠病毒cDNA”。這么做的原因主要是因為RNA只有一條鏈，結構很不穩定，稍不留神就會碎掉或者糊成一坨，這就沒法做后面的檢驗了，而雙鏈DNA就穩定得多。完成轉錄后，下面工作都將圍繞這條雙鏈的新冠病毒cDNA展開。

最主要的是第三步，進行新冠病毒cDNA的擴增與檢測。簡單來說，就是利用PCR技術（聚合酶鏈式反應）大量復制新冠病毒cDNA的數量。大家可以把cDNA的雙鏈想象成一條拉鏈，PCR的過程其實就是先拉開拉鏈，把cDNA分成兩條單鏈，然后利用“原料”核糖核苷酸合成與兩條鏈分別配對的新單鏈，再利用DNA聚合酶作為拉鏈頭，把原本拉開拉鏈產生的舊單鏈和配對好的新單鏈“拉上”，變成雙鏈。這樣原本一條拉鏈，就變成了兩條拉鏈。反復重復這個過程，新冠病毒cDNA就會呈幾何級數狀被復制擴增出來。

尋找病毒特征的NGS技術

NGS基因組測序，簡單來說，就是對咽拭子、鼻拭子、痰液等標本中所含的所有遺傳物質進行基因測序，搞清這條單鏈上每一個“鏈齒”都是什么。

NGS的技術原理比較簡單，但工作起來比較耗時。

與RT-PCR的前三步一樣，做好RNA提取、逆轉錄，然后通過PCR技術將cDNA大量擴增。

完成前三步后，通過DNA剪切酶，把完整的cDNA鏈條打碎成一系列片段，然后使用高通量測序儀，把各個片段中所含的每一個核糖核苷酸的排列順序都檢測出來，得到一個排列順序的“文庫”。

之后，只需要用已知的新冠病毒核糖核苷酸序列特征，到“文庫”中去作比對，一旦發現一致，就說明樣本里是含有新冠病毒的，也就是檢測陽性。

結果陰性也非萬事大吉

核酸檢測陰性，也并不意味著就一定沒有受到病毒感染。這種明明已經受到感染，核酸檢查卻呈現陰性的現象，被稱為“假陰性”。

任何測量、檢驗的方法都難免有誤差。如采集樣本（如咽拭子）時，沒有取到受到病毒感染的部位，樣本中就可能不含病毒;如果所取到的樣本中病毒太少，也會導致結果陰性;樣本在儲存、運輸中出問題，導致樣本中病毒核酸遭到破壞失去活性，檢測結果可能會呈現陰性;試劑盒的質量穩定和一致性等因素也可能導致出現假陰性的狀況。

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“自由散漫”催生的偉大技術

PCR的最早期理念，出自遺傳信息之父、美籍印裔科學家哈爾·葛賓·科拉納（H Gobind Khorana），科拉納20世紀70年代就多次表示，如果有合適的酶和引物，DNA是可以在體外環境下被高效合成。當時，能夠穩定使用的DNA聚合酶還沒有被發現，因此，科拉納還無法實現這一設想。

真正將PCR技術開發落地的，是美國科學家穆利斯（K Mullis）。

穆利斯是一個非常桀驁不馴且生活放蕩不羈的人，在20世紀70-80年代，穆利斯似乎受了嬉皮文化的影響，經常和人起沖突。作為一個生物化學領域的學者，他卻在自制迷幻藥的過程中突發靈感，寫了一篇解釋宇宙大爆炸的物理學論文，而這篇“用幽默的大白話寫成的論文”，居然還發表在頗具學術影響力的《自然》周刊上。隨后，穆利斯也頻繁轉換自己的研究方向，但是每一個研究方向他都很快感到厭煩。

直到1979年，穆利斯加入了Cetus生物技術公司開始生物技術研究，才稍微穩定下來。1983年春季的一天，穆利斯在高速公路上瘋狂飆車，突然迸發出了一個擴增DNA的技術靈感。

在初步實驗中，穆利斯使用了循環復制和兩個引物共同參與反應的方法，已經具備了PCR技術雛形。

1984年，穆利斯因為男女關系方面的不檢點而得罪了Cetus公司的同事，整個公司從上到下對穆利斯怨聲載道。Cetus公司告訴穆利斯，他只有1年時間，這期間公司會全力支持穆利斯的研究，如果研究失敗，穆利斯就得收拾鋪蓋走人。

在Cetus公司研究員們的共同努力之下，穆利斯團隊在1984年11月正式完成了全世界第一個PCR實驗，將一個DNA片段進行了10次PCR循環的復制擴增。PCR技術終于問世！