四種去內毒素試劑盒提取質粒中內毒素水平的比較

楊振蘋 張靜靜 邢體坤 王 斌 宋路萍 荊新蕊 宋彥君 黃 帥 王亞萍 潘若文▲

1.華蘭生物工程股份有限公司研發中心，河南新鄉 453003；2.華蘭基因工程有限公司質量控制部，河南新鄉 453000

近年來，建立在DNA基礎上的基因療法和DNA疫苗已成為一個熱門的研究方向，有望成為解決全球衛生問題的最有前景的方法之一。與重組病毒比較，重組質粒因具有免疫原性低、安全等特點而占有更大的優勢。

質粒（plasmid）是獨立于染色體外的雙鏈閉合環狀DNA分子，大小范圍為0.8～120kb，具有自主復制和轉錄能力，常以超螺旋狀態存在，廣泛存在于細菌、放線菌和真菌中[1]。質粒作為基因工程的常用載體，能夠將目的基因通過DNA重組技術轉入宿主細胞中。

內毒素（Endotoxin）最早于十九世紀由Richard Pfeiffer在研究發熱物質過程中發現并提出[2]。內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜上的特有結構，其主要化學成分是脂多糖。脂多糖由核心寡糖、雜多糖鏈、菌株特異性O抗原和疏水的脂質A組成，其中脂質A是其主要的活性位點[3]。研究表明，內毒素是誘發炎癥反應、胰島素抵抗、肺損傷等的主要致病成分[2，4-5]，對哺乳類動物有顯著的致熱性[6]。內毒素的檢測常用家兔熱源法和鱟試劑法[7]，其中，鱟試劑法是目前最常用的方法，已被列入《中華人民共和國藥典》[8]。

由于試驗目的不同，質粒DNA的質量也有不同的要求，尤其是在細胞轉染的過程中，質粒中的內毒素水平會明顯影響細胞的轉染效率，所以對質粒的質量要求更為苛刻。而面對市售的種類繁多的質粒DNA提取試劑盒，正確的選擇會成為試驗成功的關鍵。本研究選取了四種市售的去內毒素試劑盒進行質粒提取，并用鱟試劑凝膠法和動態濁度法測定所提質粒DNA的內毒素水平，為細胞轉染用質粒DNA提取試劑盒的選擇提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

質粒pCGS3保存于華蘭生物工程股份有限公司實驗室，DH5α感受態細胞購自生工生物工程股份有限公司。

1.2 試劑

四種去內毒素試劑盒為：（A）Thermo公司的GeneJET Endo-Free Plasmid Maxiprep Kit，貨號：K0861；（B）生工的UNIQ-500無內毒素質粒大量提取試劑盒，貨號：B511249；（C）QIAGEN的EndoFree Plasmid Maxi Kit，貨號：12362；（D）TaKaRa的 MidiBEST Endo-free Plasmid Purification Kit，貨號：9783S。

凝膠法鱟試劑（批號：1904083，λ=0.06EU/mL）、動態濁度法鱟試劑（批號：1809270）、細菌內毒素國家標準品（批號：1612010，80EU/支）、細菌內毒素檢查用水（批號：1812040）均購自湛江安度斯生物有限公司。

1.3 儀器

超凈工作臺（蘇凈集團有限公司，SW-CJ-1F），全溫搖瓶柜（太倉市實驗設備廠，HYG-A），NanoDrop分光光度計（Thermo公司，NanoDrop ONE），電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司，HWS-28），動態試管檢測儀（湛江安度斯生物有限公司，LKL-164-03）。

1.4 方法

1.4.1 質粒DNA提取 用pCGS3質粒轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，培養獲得攜帶pCGS3質粒的菌液，之后分別用四種無內毒素質粒提取試劑盒提取質粒，每組做3個平行管。提取的質粒用NanoDrop ONE分光光度計測定質粒DNA濃度、A260/A280、A260/A230，進行質粒DNA的質量評價。

1.4.2 凝膠法 鱟試劑靈敏度的復核：根據《中華人民共和國藥典》2015年版[8]中收錄的細菌內毒素檢測法，首先將細菌內毒素國家標準品稀釋成四個濃度的內毒素標準溶液，濃度分別為：0.12、0.06、0.03、0.015EU/mL。然后分別吸取100μL上述內毒素標準溶液，加入100μL待復核的鱟試劑中，每組做4個平行管。同時，取100μL細菌內毒素檢查用水加入100μL待復核的鱟試劑中，用作陰性對照，陰性對照平行做2管。封閉管口，輕輕混勻，垂直放入37℃恒溫水浴鍋中，保溫60min。觀察凝膠凝結情況，并按公式λc=lg-1（ΣX/4）計算鱟試劑的實際靈敏度（λc）。其中，X為反應終點濃度的對數值，反應終點濃度是指梯度稀釋的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。

當λc在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）范圍內，表示該鱟試劑可用于細菌內毒素的檢測。

1.4.3 動態濁度法

1.4.3.1 標準曲線的可靠性實驗 用細菌內毒素檢查用水將細菌內毒素國家標準品稀釋成1.00、0.10和0.01EU/mL三個梯度的內毒素標準溶液。分別吸取100μL上述內毒素標準溶液，加入100μL的鱟試劑溶液，每組做3個平行管。同時，取100μL細菌內毒素檢查用水作陰性對照，陰性對照平行做2管。輕輕混勻，放入動態試管檢測儀中于37℃自動采集數據。將內毒素濃度C對達限時間T進行線性回歸分析。所得線性回歸方程的相關系數r的絕對值≥0.980，則試驗有效。

1.4.3.2 供試品的干擾試驗 將四種去內毒素試劑盒所得質粒用細菌內毒素檢查用水進行適度稀釋，參照《中華人民共和國藥典》2015年版[8]中細菌內毒素檢測法進行干擾實驗。根據所得線性回歸方程，分別計算供試品溶液中的內毒素含量Ct和含標準內毒素的供試品溶液中的內毒素含量Cs，然后按下列方程式計算回收率（R）：

當回收率在50%～200%時，則認為供試品溶液不存在干擾。

1.4.4 質粒內毒素水平測定 （1）凝膠法測定質粒DNA中的內毒素水平。首先將質粒DNA進行梯度稀釋，然后向鱟試劑中加入100 μL的細菌內毒素檢查用水和100 μL質粒混勻，每組重復3管。同時，取100 μL的細菌內毒素檢查用水作為陰性對照，陰性對照做2個平行管。輕輕混勻，置于37℃水浴鍋中孵育60min。將試管從水浴鍋中輕輕取出，緩緩倒轉180°，觀察凝膠形成情況。若管內形成不變形、不滑脫的凝膠，則為陽性；若管內沒有形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形易滑脫則為陰性。（2）動態濁度法測定質粒DNA中的內毒素水平。參照動態濁度法鱟試劑說明書檢測質粒DNA中內毒素水平，每組做3管平行，然后根據回歸方程計算內毒素含量。

1.5 統計學分析

試驗所得數據用統計學軟件SPSS17.0進行分析，數據以（）的形式表示。

2 結果

2.1 四種去內毒素試劑盒提取質粒DNA結果

質粒DNA提取操作步驟詳見試劑盒說明書。分別取質粒樣品5μL，用洗脫液作為空白對照，用NanoDrop ONE分光光度計測定質粒的濃度、A260/A280值、A260/A230值。結果顯示，四種去內毒素試劑盒所提質粒的得率、純度均與說明書一致。測定結果見表1。

表1 四種無內毒素試劑盒提取質粒DNA測定結果

2.2 凝膠法鱟試劑靈敏度的復核

用細菌內毒素檢查用水作為稀釋液，將細菌內毒素國家標準品稀釋成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，以細菌內毒素檢查用水做2支陰性對照，參照《中華人民共和國藥典》2015年版[8]中細菌內毒素的檢測法，進行鱟試劑的λ復核。結果顯示，λc=0.05EU/mL，在0.5λ～2λ范圍內，表明該鱟試劑可用于內毒素檢測。復核結果見表2。

表2 鱟試劑的靈敏度λ復核結果

2.3 動態濁度法

2.3.1 標準曲線的可靠性實驗 將內毒素國家標準品進行3個梯度稀釋，濃度分別為：1.00、0.10、0.01EU/mL。然后根據說明書操作，測定3個標準濃度達到預設的濁度值所用的時間。結果如表3所示。將內毒素濃度C對達限時間T進行線性回歸分析，得回歸方程：lgT=2.8008-0.3100lgC，其中，相關系數︱r︱=0.9973＞0.980，最低檢測濃度為0.01EU/mL，平行管的變異系數小于10%，NC反應時間＞3600s，在檢測時間外，綜上所述，標準曲線成立，可用于后續結果計算。

表3 標準曲線可靠性試驗數據

2.3.2 供試品的干擾試驗 以質粒樣品稀釋倍數8為例，進行回收率計算，計算結果如表4所示。內毒素的回收率均在50%～200%之間，所以在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。

表4 供試品的干擾試驗回收率結果

2.4 四種去內毒素試劑盒提取質粒DNA中內毒素水平檢測結果

分別用鱟試劑凝膠法和動態濁度法檢測四種不同去內毒素試劑盒所提質粒DNA內毒素的水平。首先，將質粒樣品稀釋后用于凝膠法檢測，記錄凝膠形成情況；再用動態濁度法測定質粒樣品中內毒素，根據回歸方程計算內毒素水平，結果見表5。結果表明，凝膠法和動態濁度法檢測結果一致，且內毒素含量均符合試劑盒說明書要求，小于0.1EU/μg。

表5 質粒DNA內毒素水平測定結果

3 討論

內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜上的特有結構，通常會在細菌生長、死亡中被釋放。內毒素表面帶負電荷、易形成微囊結構，其分子量、電荷性和疏水性都與質粒DNA相似，使用常規的質粒提取方法很難將其與質粒DNA完全分開[9]。此外，在細胞轉染過程中，內毒素與質粒DNA競爭轉染試劑，阻礙質粒DNA進入細胞膜和核孔復合物，能顯著降低內毒素敏感細胞株的轉染效率[10-11]。在用電穿孔進行細胞轉染中，內毒素含量與細胞轉染率、細胞凋亡率有極強的相關性[12]。因此，應盡可能降低用于細胞轉染的質粒DNA中內毒素的含量。

在國外，基因治療用質粒DNA制品的細菌內毒素殘留量標準為不超過0.1EU/μg[10]。在本實驗中，采用凝膠法和動態濁度法檢測四種質粒提取試劑盒所提質粒的內毒素水平，檢測結果表明，4種試劑盒所提質粒的內毒素含量均小于0.1EU/μg，均能滿足后續細胞轉染實驗的要求。從質粒得率、內毒素殘留量和性價比綜合分析，C試劑盒質粒得率最高，內毒素含量最低，但價格也最貴；而B試劑盒雖然質粒得率不及其他3個，但內毒素含量僅次于C，性價比也最高。

本實驗采用的凝膠法和動態濁度法檢測結果相符，內毒素水平均小于內毒素的限值。凝膠法只能定性地判定結果是否符合《中華人民共和國藥典》規定，而動態濁度法可以定量地測出樣品中的內毒素含量。除此之外，隨著我國鱟資源的逐年減少[13]，一種新的內毒素檢測方法-重組C因子法正在推廣使用。重組C因子法將鱟試劑中的C因子采用生物技術重組獲得，以此來替代海洋生物鱟作為鱟試劑原料的唯一來源[14]。該方法已得到歐洲藥典、美國食品藥物管理局（FDA）的官方認可，其列入《中華人民共和國藥典》也指日可待。

疫苗生產過程中的每一個環節都有可能污染內毒素導致制品不合格，不僅給生產企業造成嚴重的經濟損失，也會直接影響該企業的口碑。并且，隨著GMP、ICH等文件對生物制品質量要求的規定不斷提高，對內毒素的要求也越來越嚴格[15-16]。因此，疫苗生產人員必須采取有效措施控制產品內毒素含量，保證接種者的人身安全。而質粒生產作為疫苗上游研發過程中的重要環節，其質粒內毒素水平直接影響后續的細胞轉染、穩定細胞株的篩選等。因此，獲得內毒素水平符合要求的質粒至關重要。

本研究結果為細胞轉染用質粒提取試劑盒的選擇提供基礎。本實驗所選的4種去內毒素質粒提取試劑盒所提質粒均能滿足細胞轉染的要求，但不同的試劑盒質粒得率、內毒素含量和價格不同，使用時應根據實際情況綜合考慮。